張冰雪　范付華等

摘 要：【目的】為了構(gòu)建火龍果芽變種質(zhì)的DNA指紋圖譜，并揭示種質(zhì)間的遺傳關(guān)系，【方法】以貴州近幾年選育的一些優(yōu)良火龍果種質(zhì)為試材，采用ISSR標(biāo)記技術(shù)和NTSYS 2.01軟件對(duì)這些新種質(zhì)及其原始品種進(jìn)行分析?！窘Y(jié)果】利用篩選出的52條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出364個(gè)清晰、重復(fù)性好的標(biāo)記，其中215個(gè)（60%）為多態(tài)性標(biāo)記。M08、845和881 等3個(gè)引物擴(kuò)增出的標(biāo)記能將22份種質(zhì)區(qū)分開來。采用NTSYS 2.01軟件計(jì)算，供試種質(zhì)間的相似性系數(shù)為0.70～0.96，平均0.81，其中紅肉種質(zhì)間平均值為0.82，白肉為0.89。UPGMA聚類分析顯示，在相似系數(shù)0.9處可將供試材料分為11類，其中7份分別各自聚類（紅肉占86%）。【結(jié)論】火龍果體細(xì)胞變異率較高，且紅肉品種高于白肉品種，通過芽變選種能有效地實(shí)現(xiàn)遺傳改良。

關(guān)鍵詞：火龍果； 貴州； ISSR； 遺傳多樣性； DNA指紋圖譜

中圖分類號(hào)：S667.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980？穴2013？雪04-0573-05

火龍果（Hylocereus undatus）為仙人掌科量天尺屬（Hylocereus）的果用栽培植物，原產(chǎn)于巴西、墨西哥等中美洲熱帶沙漠地區(qū)[1]，目前在我國(guó)臺(tái)灣及華南地區(qū)有一定規(guī)模的種植[2]。貴州屬南亞熱帶和中亞熱帶氣候，早在2000年就開始引種栽培火龍果[3]，近年來通過芽變育種從紅龍果（紅肉）和白玉龍（白肉）兩個(gè)品種中選出22個(gè)優(yōu)良種質(zhì)。分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于果樹種質(zhì)的遺傳多樣性分析。ISSR（inter-simple sequence repeat）是一種新型的DNA標(biāo)記，它結(jié)合了RAPD和SSR的優(yōu)點(diǎn)，已成為果樹種質(zhì)遺傳關(guān)系研究的主要方法[4-5]。迄今，涉及火龍果分子標(biāo)記的報(bào)道較少[6]，本文擬利用ISSR標(biāo)記構(gòu)建貴州近年選育的火龍果芽變新種質(zhì)的DNA指紋圖譜，并分析其遺傳關(guān)系，為貴州火龍果種質(zhì)的保護(hù)和遺傳改良提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 DNA的提取及檢測(cè)

1.3 PCR擴(kuò)增及檢測(cè)

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

每個(gè)引物的擴(kuò)增反應(yīng)設(shè)3次重復(fù)。檢測(cè)結(jié)果顯示，絕大部分帶型可重復(fù)，極少數(shù)不能重復(fù)的譜帶統(tǒng)計(jì)時(shí)忽略不計(jì)。統(tǒng)計(jì)譜帶時(shí)按“引物編號(hào)-片段長(zhǎng)度”進(jìn)行記錄，建立數(shù)據(jù)庫，并分別用NTSYS 2.01軟件與UPGMA法進(jìn)行其相似性系數(shù)的計(jì)算和遺傳關(guān)系樹狀圖的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR標(biāo)記的多態(tài)性分析

2.2 DNA指紋圖譜

2.3 遺傳關(guān)系和聚類分析

3 討 論

3.1 火龍果品種鑒定和指紋圖譜的構(gòu)建

火龍果沒有葉片，植株形態(tài)標(biāo)記很少，與其他果樹相比單從形態(tài)上更不易區(qū)分。分子標(biāo)記能客觀地反映其不同種質(zhì)之間的基因組差異，不受取樣部位和時(shí)間等因素的影響，是一種簡(jiǎn)單有效的方法。Wolfe 等[6]研究證明，ISSR分子標(biāo)記能靈敏地揭示遺傳關(guān)系十分相近個(gè)體間的差異。此外，Moreno等[7]研究證明，由于ISSR引物序列較長(zhǎng)（16～25 bp），PCR擴(kuò)增的退火溫度較高，其擴(kuò)增結(jié)果的重演性較高。Junqueira等[8]利用RAPD標(biāo)記對(duì)16份火龍果種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明來自相同品種的不同種質(zhì)其遺傳差異性也較大，并認(rèn)為分子標(biāo)記技術(shù)在遺傳育種中至關(guān)重要。相對(duì)于其他分子標(biāo)記，ISSR具有成本較低、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)[9]。迄今，利用分子標(biāo)記鑒別火龍果品種和構(gòu)建指紋圖譜的報(bào)道相對(duì)較少。本文利用52條ISSR引物對(duì)22個(gè)貴州火龍果種質(zhì)進(jìn)行遺傳關(guān)系分析，共擴(kuò)增出364條譜帶，215條具有多態(tài)性，多態(tài)性比率（60%）高于Junqueira等[8]應(yīng)用RAPD標(biāo)記分析火龍果資源的研究結(jié)果。

22份種質(zhì)的DNA指紋圖譜顯示，3份抗逆性種質(zhì)的DNA在890-625處共同缺失。20號(hào)在引物825、827、841、848和862中的共獲得5個(gè)特征性標(biāo)記；21號(hào)在M03、813和835等9條引物中共獲得17個(gè)特征標(biāo)記，22號(hào)在865-1000處獲得特征性標(biāo)記，且這23個(gè)特征標(biāo)記除825-375外，均為陰性標(biāo)記。這說明ISSR可用于火龍果種質(zhì)鑒別和指紋圖譜構(gòu)建。同時(shí)，這也表明火龍果抗逆性種質(zhì)的突變類型可能是缺失型突變，但這些缺失片段是否真與其抗逆性有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。

3.2 火龍果種質(zhì)間的遺傳關(guān)系

本文通過ISSR技術(shù)對(duì)22份火龍果材料進(jìn)行遺傳關(guān)系分析，結(jié)果表明，相同肉色的火龍果資源基本聚為一類。這與Grimaldo-Juárez等[10]的對(duì)紅、白、黃和紫紅四種不同肉色的21份火龍果資源的形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)的研究結(jié)果一致，其聚類分析結(jié)果顯示，在遺傳距離約1處它們基本按肉色分為4組。由此可見，決定火龍果肉色的遺傳基礎(chǔ)差異較大。值得注意的是，這一結(jié)果與我們對(duì)火龍果花器官結(jié)構(gòu)差異較大的觀察結(jié)果相吻合。前期研究發(fā)現(xiàn)，白肉火龍果資源的花筒處有明顯彎曲，其雄蕊與柱頭可接觸，而紅肉火龍果的花筒彎曲程度較小，其雄蕊明顯低于柱頭；此外，兩者在花的外形上差異也較大，白肉火龍果的花較瘦弱；而紅肉火龍果的花較飽滿。因此，利用ISSR標(biāo)記進(jìn)行火龍果遺傳關(guān)系的分析是高效而可行的。至于ISSR標(biāo)記和植物學(xué)及農(nóng)藝性狀間的遺傳關(guān)系尚待進(jìn)一步研究。

火龍果種質(zhì)資源遺傳關(guān)系評(píng)價(jià)能為其合理利用和種質(zhì)創(chuàng)新提供有利的依據(jù)。本文收集的火龍果資源，主要包含白肉和紅肉兩種資源，但兩種資源中又包含不同抗逆性種質(zhì)。本研究采用52條ISSR引物，對(duì)貴州22份火龍果種質(zhì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，表現(xiàn)出較豐富的多態(tài)牲。李俊麗等[11]認(rèn)為從分子水平來看，遺傳距離的變幅越大，說明其遺傳分化越大；遺傳多樣性高低與遺傳背景復(fù)雜程度及該物種存在的歷史長(zhǎng)短密切相關(guān)。2種肉色火龍果資源中的抗逆性種質(zhì)均單獨(dú)聚類，這似乎說明決定火龍果抗性強(qiáng)弱的DNA遺傳差異較大，也在一定程度上印證了群體的遺傳多樣性越高，其抗逆性越高的觀點(diǎn)[12-13]。

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