張承旻

（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 貴州 遵義 563099）

1 背景

小腸粘膜下層（small intestinal submucosa，SIS）是將小腸去除漿膜層、肌層及黏膜層，以及一系列加工和消毒處理后，獲得的一種不含細胞的細胞外基質(zhì)。是一種理想的組織工程學(xué)材料。其在組織修復(fù)方面具有3方面的生物學(xué)優(yōu)勢。1、組織相容性：SIS主要由Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白構(gòu)成，并含有豐富的纖維連接蛋白［1］及生長因子，即使經(jīng)過一系列加工處理后SIS仍還有這些生長因子［2、3］。如成纖維細胞生長因子－2、轉(zhuǎn)移生長因子－β、血管內(nèi)皮生長因子、血小板源性生長因子等。這些物質(zhì)均為正常細胞外基質(zhì)的成分。其中Ⅰ型膠原蛋白及纖維連接蛋白均可于細胞膜特異性結(jié)合，并激活細胞傳導(dǎo)通路促進細胞的粘附［4］；而各種生長因子也可以刺激細胞增殖。SIS不僅能為宿主細胞提供附著和遷移的自然環(huán)境，還能很快與宿主組織結(jié)合，促進血管生成，恢復(fù)組織功能。2、免疫原性和安全性：經(jīng)過機械法和化學(xué)法聯(lián)合處理的SIS不含細胞，其攜帶病原體的概率很低，而且其免疫原性弱，即使異種移植后亦不產(chǎn)生排斥反應(yīng)［5］。SIS經(jīng)消毒處理后，所含有的各種組分不會丟失或失活，超微結(jié)構(gòu)及機械特性無明顯改變。因此，經(jīng)消毒處理后SIS具有較高的安全性。同時Sarikaya A等［6］指出SIS浸出液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有抑制作用，可以抑制細菌的生長。3、生物力學(xué)性能：小腸黏膜下層是一種非線性材料，在縱軸方向（無論是否刨開管壁）的抗拉伸強度相當(dāng)于肌腱和韌帶組織的1／7到1／4［7］。SIS作為體內(nèi)組織工程的材料，具有適當(dāng)?shù)臋C械特性，能承受周圍組織壓力，為再生細胞提供足夠的生長空間。

SIS因為其良好的生物學(xué)優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究及臨床替代材料。Bejjani GK等［8］用SIS作為硬脊膜替代材料治療了59例臨床病人，其中包括Chiari畸形、腦部腫瘤患者術(shù)中需要修補硬脊膜者，術(shù)后隨訪僅1例并發(fā)腦脊液漏，2例并發(fā)感染。其余患者均恢復(fù)良好。SIS還被用于疝、肛瘺的修復(fù)，以及作為皮膚替代材料等。

作為組織工程學(xué)支架材料首先必須具備細胞相容性，由于研制的組織工程化組織最終的目的是要移植入生物體，因此必須能與生物系統(tǒng)相結(jié)合。支架材料的細胞相容性包括細胞在材料中的粘附、擴展、遷移、生長及功能特性。目前對SIS細胞相容性的研究非常多。

2 SIS與細胞相容性研究進展

2.1 SIS與骨髓基質(zhì)干細胞（BMSC）相容性：張開剛等［9］用SIS與BMSC體外構(gòu)建組織工程骨膜。在體外聯(lián)合培養(yǎng)過程中用相差顯微鏡、掃描電鏡及透射電鏡觀察，認為SIS本身所含有的活性生長因子可促進兔BMSC的分化、增殖。細胞培養(yǎng)7天后附著材料表面數(shù)量明顯增多，10天后細胞連成一片，2周時細胞數(shù)量更多，細胞層數(shù)也更多。通過透射電鏡觀察，BMSC在SIS上細胞核成梭型或不規(guī)則型，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富、擴張，細胞基質(zhì)致密。說明在SIS上的BMSC細胞活力強，但隨著時間延長，底層細胞活力比上層減弱。王軍勝等［10］通過用不同方法預(yù)濕SIS，證明胎牛血清預(yù)濕的SIS可以使兔BMSC較早的伸展完全粘附于SIS支架上。他們認為胎牛血清可以保護細胞、促進細胞粘附及增殖。

2.2 SIS與前脂肪細胞相容性：蘭海等［11］取人脂肪組織消化后與SIS聯(lián)合培養(yǎng)。通過MTT法檢測。對照組細胞接種1天后進入快速增殖期，而材料組經(jīng)過3天潛伏期后快速增殖，兩組增殖速度接近，材料組比對照組晚6天進入平臺期。認為SIS含有的細胞外基質(zhì)成分促進人前脂肪細胞增殖，而且其空間結(jié)構(gòu)也有利于細胞生長及粘附。

2.3 SIS與schwann細胞相容性：蘇琰等［12］在體外復(fù)合培養(yǎng)SCs與SIS，通過組織學(xué)方法檢測SCs在SIS支架上生長的情況，并通過SCs分泌神經(jīng)生長因子（NGF2β）和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）量的多少來檢測SCs的細胞活性。通過相差顯微鏡和掃描電鏡觀察，可見SCs在SIS表面能夠良好地黏附，生長活躍，增殖旺盛；通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)SCs與SIS復(fù)合培養(yǎng)后，其分泌NGF2β與BDNF的神經(jīng)營養(yǎng)因子功能良好，與正常培養(yǎng)的SCs無顯著性差異。通過這兩方面的檢測證明SCs與SIS相容性良好。盧洪凱等［13］將SCs與SIS體外復(fù)合培養(yǎng)后移植到CN神經(jīng)損傷大鼠模型神經(jīng)損傷處，術(shù)后3個月行阿樸嗎啡試驗及檢測大鼠海綿體內(nèi)nNOS表達，證明SCs與SIS復(fù)合移植物可以修復(fù)CN損傷。傅一山等［14］將SCs與SIS復(fù)合培養(yǎng)后移植修復(fù)大鼠損傷脊髓，術(shù)后4－12周進行形態(tài)學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)移植處炎性細胞浸潤不明顯，有大量再生的有髓神經(jīng)軸突，無明顯變性壞死和膠質(zhì)瘢痕增生現(xiàn)象。

2.4 SIS與成骨細胞相容性：羅靜聰?shù)龋?5］利用人胚骨膜成骨細胞（HEPOB）與SIS體外培養(yǎng)，通過形態(tài)學(xué)檢測，HEPOB24小時后在SIS周邊粘附，隨著時間延長細胞數(shù)量增多，融合成片，細胞計數(shù)均在5天時達最高值，而復(fù)合培養(yǎng)細胞計數(shù)5天時較3天時計數(shù)加倍率高于單純培養(yǎng)組，說明SIS可促進HEPOB的增殖。

2.5 SIS與上皮細胞相容性：Gabouev AL等［16］在SIS上種植膀胱上皮細胞和膀胱平滑肌細胞，免疫組織化學(xué)染色顯示，在SIS上形成了膀胱上皮細胞和膀胱平滑肌細胞雙層結(jié)構(gòu)，說明利用SIS可以成功地制成組織工程化的膀胱壁。Lindberg K等［17］將上皮細胞種植在SIS上，第2天上皮細胞即出現(xiàn)2～3層上皮樣結(jié)構(gòu)，10余日后SIS表面下出現(xiàn)小的成簇的上皮細胞，顯現(xiàn)出分層的鱗狀上皮樣結(jié)構(gòu)，組織學(xué)觀察可見基本成熟的上皮結(jié)構(gòu)，而且上皮細胞表現(xiàn)出優(yōu)先遷入SIS的管狀結(jié)構(gòu)。譚波等［18］采用混合酶消化法，于6%胎牛血清的上皮細胞無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)犬空腔粘膜上皮細胞（OMECs），將第2代犬OMECs接種在SIS上，行蘇木精－伊紅染色、免疫組織化學(xué)染色、掃描電鏡等觀察OMECs在SIS上的生長狀況。OMECs接種在SIS上呈單層生長，多角形，鋪路石樣排列，復(fù)合培養(yǎng)8天后呈多層生長。

2.6 SIS與胰島細胞相容性：Woods EJ等［19］將純化的胰島細胞種植在SIS上，并給予糖刺激，根據(jù)放射免疫法檢測顯示，第2周末胰島細胞表現(xiàn)出高胰島素分泌，第3周末胰島細胞與對照組相比，形態(tài)正常，胰島素分泌量增加。用SIS作為支架材料對胰島細胞進行移植，能夠加強胰島細胞在體外的功能和活性，是臨床治療糖尿病的新方法。

2.7 其它：楊志明等［15］體外培養(yǎng)人胚皮膚成纖維細胞（HESFB）與兔腎血管內(nèi)皮細胞（RRVEC），并在體外與SIS復(fù)合培養(yǎng)。通過MTT法測定細胞增殖，用流式細胞儀檢測復(fù)合培養(yǎng)細胞在不同培養(yǎng)時間的細胞周期、細胞凋亡。等到SIS對兩種細胞的細胞周期及細胞凋亡均無影響。SIS與HESFB、RRVEC有良好的相容性。

3 結(jié)語

因為小腸粘膜下層本身為細胞外基質(zhì)，經(jīng)過處理后無免疫原性及毒性，但是含有許多有利于細胞粘附及生長的細胞因子，是一種理想的天然可降解組織工程學(xué)支架材料。現(xiàn)在SIS已經(jīng)在基礎(chǔ)及臨床方面進行了大量研究，SIS在基礎(chǔ)實驗中與多種細胞在體外復(fù)合培養(yǎng)均顯示SIS有良好的細胞相容性。但是現(xiàn)在主要是應(yīng)用SIS本身所含有的細胞因子來促進細胞在SIS上粘附、增殖，只有個別學(xué)者［10］對SIS進行預(yù)處理后再與細胞復(fù)合培養(yǎng)。目前沒有一種理想的預(yù)處理方式可以使細胞在SIS上更好的粘附、增殖，也沒有文獻報道過SIS上粘附細胞的具體數(shù)量。所以對于SIS的細胞相容性還需更多的關(guān)注及研究。

［1］張開剛，曾炳芳，張長青.骨髓基質(zhì)干細胞復(fù)合小腸黏膜下層體外構(gòu)建組織工程骨膜的實驗研究［J］.中華外科雜志，2005.12：1594－1597

［2］王軍勝，王栓科，高恩建，等.不同預(yù)濕方法對構(gòu)建組織工程骨膜細胞黏附率的影響［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù).2008.04.08：2806－2810

［3］蘭海，黃富國，楊志明，等.前脂肪細胞在小腸黏膜下層的生長與增殖［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù).2010.06.18：4599－4602