杜亞平 張澤富 忽景泰 吳懷敏 謝建軍

1.廣東省珠海市第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科 519020 2.中山大學(xué)第五醫(yī)院影像科 廣東珠海 519000 3.廣東省珠海市第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 519020

大腸癌是嚴(yán)重影響人類生存的常見惡性腫瘤之一，目前治療主要以手術(shù)為主輔以放療和細(xì)胞毒性藥物化療，但還有半數(shù)的病人死于再發(fā)和轉(zhuǎn)移［1］。通過RNAi的技術(shù)將C－FLIP的siRNA片段對(duì)大腸癌凋亡的影響，探究RNAi的靶向沉默C－FLIP基因在TRAIL介導(dǎo)的凋亡途徑中的作用機(jī)理，并期望使之成為大腸癌治療的新手段。

資料與方法

細(xì)胞株與試劑:人卵大腸癌細(xì)胞株，以及各實(shí)驗(yàn)所需相關(guān)試劑。

實(shí)驗(yàn)方法:①細(xì)胞實(shí)驗(yàn):用電穿孔技術(shù)把c－FLIP(L)對(duì)應(yīng)的SiRNA片段轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，半定量RT－PCR法判斷干擾前后FLIP mRNA水平的變化，Western blot分析FLIP蛋白水平變化，比較對(duì)應(yīng)不同位點(diǎn)的兩個(gè)片段對(duì)的干擾效果經(jīng)凋亡誘導(dǎo)型杭體激活后，以染色法及降解片段檢測(cè)分析干擾前后細(xì)胞對(duì)介導(dǎo)的凋亡敏感性的改變。四甲基偶氮唑鹽(MTT)法及流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)c－FLIP(L)－siRNA轉(zhuǎn)染前后TRAIL對(duì)SW480細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的變化。以Annexin－V－PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)(FCM)比較c－FLIP(L)－siRNA轉(zhuǎn)染前后TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的情況。②動(dòng)物實(shí)驗(yàn):通過構(gòu)建脂質(zhì)體介導(dǎo)的c－FLIP(L)－siRNA在脂質(zhì)體(LipofectamineTm2000)介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染大腸癌裸鼠移植瘤模型，將其分組。觀察c－FLIP(L)－siRNA對(duì)大腸癌裸鼠移植瘤的作用。具體方法，見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)方案流程圖

實(shí)驗(yàn)分組:未做任何處理的大腸癌胞株SW480為空白組;轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體Lipofectamine2000的SW480細(xì)胞脂質(zhì)體組;轉(zhuǎn)染NC－siRNA的SW480為陰性對(duì)照組;轉(zhuǎn)染c－FLIP(L)－SiRNA的SW480是FLIPL組。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用X2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

具體結(jié)果，見表1。

表1 轉(zhuǎn)染c－FLIP(L)－SiRNA后TRAIL對(duì)SW480胞株的凋亡作用

討 論

目前該大腸癌基因研究主要包括免疫基因治療、自殺基因治療、癌基因和抑癌基因的基因治療、抗癌血管生成基因治療、改善腫瘤化療療效的基因治療和聯(lián)合治療等［2］?，F(xiàn)如今對(duì)大腸癌尚無肯定的基因治療方法，利用RNAi技術(shù)將c－FLIP(L)對(duì)應(yīng)的SiRNA片段對(duì)大腸癌細(xì)胞株SW480凋亡的影響，明確RNAi靶向沉默c－FLIP基因在TRAIL介導(dǎo)的凋亡途徑中的作用，來指導(dǎo)臨床治療。

FLIP作為一種重要的凋亡抑制蛋白，可通過抑制caspase－8的活化來阻斷死亡受體通路，發(fā)揮凋亡抑制效應(yīng)。C－FLIP與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，阻斷caspase蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而抑制Fas、TNFR－1、DR5、TRAILR 等死亡受體介導(dǎo)的凋亡。c－FLIP對(duì)由代謝抑制劑引起的翻譯受阻具有高度的敏感性。c－FLIP特異的代謝抑制劑處理后，可減小癌細(xì)胞的生存能力，提高其死亡率。以治療c－FLIP蛋白過表達(dá)的致命疾病隨著對(duì)c－FLIP分子調(diào)節(jié)機(jī)制的深入研究，以c－FLIP或其調(diào)節(jié)分子為靶點(diǎn)，對(duì)腫瘤及自身免疫性疾病進(jìn)行基因治療研究，有了更為廣闊的前景。

1 白玉賢，劉磊，隋紅，等.miRNA干擾Pokemon基因?qū)Υ竽c癌細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制［J］.臨床腫瘤學(xué)雜志，2011，16(11):970 ～973.

2 張孟賢，韓娜，于世英.RNA干擾沉默HDAC1基因?qū)Υ竽c癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響［J］.世界華人消化雜志，2008，16(11):1173－1178.