張榮華 王冰

哈藥集團技術(shù)中心 黑龍江哈爾濱 150025

為了達到基因治療的目的，目前已經(jīng)建立許多基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，這些方法為基因治療的最新進展做出了很大的貢獻。哺乳動物細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)就是將構(gòu)建出來的目的基因通過載體導(dǎo)入不同的哺乳動物細胞內(nèi)，進行基因功能研究的方法，轉(zhuǎn)染大致可分為物理轉(zhuǎn)導(dǎo)、化學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)和病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)三種途徑。

物理轉(zhuǎn)導(dǎo)

是利用物理力量導(dǎo)致細胞膜的瞬間缺損，從而使DNA 質(zhì)粒進入細胞內(nèi)的方法，如電穿孔法、基因槍法、注射法等。

注射法:直接將DNA 質(zhì)粒注射入組織細胞中以達到基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的目的。注射法還可以將裸露的DNA 質(zhì)粒注射入肌肉、肝臟、皮膚等組織，有研究報道將DNA 質(zhì)粒逆行注入到肝靜脈和膽管后能夠高效表達［1］。

基因槍法:是把壓縮氣體(氮或氦)轉(zhuǎn)換成氣體時所產(chǎn)生的沖擊波作為動力，把DNA 質(zhì)粒直接射入組織、細胞和細胞器中，基因槍導(dǎo)入的基因被證明可在各種類型的細胞中得到瞬時高效表達。

電穿孔法:通過短暫高強度的電場作用，瞬時提高細胞膜的通透性，將DNA 質(zhì)粒導(dǎo)入細胞內(nèi)。電穿孔法是一種既可以用于體外也可以用于體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移方法。目前體內(nèi)用電穿孔法導(dǎo)入基因主要用于皮膚和肌肉組織。Molnar 等于2004 年［2］，采用電穿孔法將外源基因?qū)朊庖呷毕菔篌w內(nèi)，此基因穩(wěn)定表達超過1 年時間。王強等用電穿孔法將pGFP 質(zhì)粒導(dǎo)入K562 白血病細胞中［3］，獲得90%以上的表達綠色熒光的細胞，穩(wěn)定表達半年以上。錢鋒等通過電穿孔法使非貼壁細胞和難轉(zhuǎn)染細胞得到轉(zhuǎn)染［4］。

化學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)

化學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要包括陽離子脂質(zhì)體和陽離子聚合物轉(zhuǎn)導(dǎo)。陽離子脂質(zhì)體或陽離子聚合物通過細胞吞噬或吞飲作用將目的基因攜帶進入靶細胞中。

陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)導(dǎo):1987 年，自從Felgner 等首次發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體可以轉(zhuǎn)移基因后［5］，大量被改良的陽離子脂質(zhì)體用于轉(zhuǎn)移基因。在美國和歐洲，陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)導(dǎo)外源的基因療法交付目前占正在進行的基因治療臨床試驗的9% ～12%［6］。劉志國等采用Lipofectine 轉(zhuǎn)染方法達到了外源基因在CHO 細胞中高效瞬時表達的目的［7］。

陽離子聚合物轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移:第一個被用于基因轉(zhuǎn)移的陽離子聚合物是多聚賴氨酸，此后越來越多的分枝狀或線狀的陽離子聚合物被用于外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。其中主要包括人工合成的如聚甲基丙烯酸(PMA)、聚乙烯亞胺(PEI)等［8］。孫祥明等將PEI 攜帶DNA 質(zhì)粒導(dǎo)入密度為1 ×107個/ml 細胞中［9］，轉(zhuǎn)染8 天后，在10．7L 培養(yǎng)液中收集到227mg 的EPO 蛋白。

病毒介導(dǎo)

將目的基因整合到特定的病毒中，通過病毒感染細胞，使目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入細胞中。能夠進行轉(zhuǎn)導(dǎo)的病毒包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、痘病毒和桿狀病毒。總的來說，病毒體系時間長代價高也比較復(fù)雜，操作不當(dāng)還可能有潛在的危險。

結(jié)語

綜上所述，電穿孔法、陽離子脂質(zhì)體法、陽離子聚合物法和病毒法因轉(zhuǎn)染效率高，成為近年來應(yīng)用較多的哺乳動物細胞轉(zhuǎn)染方法。但每種方法也有其自身的局限性:電穿孔法細胞死率高;脂質(zhì)體法在體內(nèi)能夠引起免疫反應(yīng);陽離子聚合物法有某些細胞毒性;病毒法則需考慮轉(zhuǎn)染后的安全因素。只有選擇合適的方法，才有利于外源基因在宿主細胞中的高效表達。

1 Zhang G，Vargo D，Budker V，et al．Expression of naked plasmid DNA injected into the afferent and efferent vessels of rodent and dog livers［J］．Hum Gene Ther，1997(8):1763．

2 Molnar MJ，Gilbert R，Lu Y，et al．Factors influencing the efficacy，longevity，and safety of electroporation assisted plasmid based gene transfer into mouse muscles［J］．Mol Ther，2004(10):447．

3 王強，劉紅云，沈關(guān)心．綠色熒光蛋白白血病雞胚模型的構(gòu)建［J］． 華中醫(yī)學(xué)雜志，2006(1):67．

4 錢鋒，肖成組．電擊緩沖液對哺乳動物細胞電穿孔效率的影響［J］．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，1999，23(2):101-103．

5 Felgner PL，Gadek TR，Holm M，et al．Lipofection:a highly effi cient，lipid mediated DNA transfection procedure［J］． Proc Natl Acad Sci USA，1987(84):7413．

6 Alexander V Kabanov． Taking polycation gene delivery systems from in vitro to in vivo［J］．Today，1999，2(9):365-372．

7 劉志國，屈伸．DNA 高效轉(zhuǎn)染CHO 細胞的研究． 武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報，2002(1):4-6．

8 Boussif O，Lezoualch F，Zanta MA，et al．A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo:polyethylenimine［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1995(92):7297．

9 Xiangming Sun，Hui Ching Hia，Peen Ern Goh，Miranda G．S．Yap． Highdensity transient gene expression in suspension-adapted 293 EBNA1 cells［J］．Biotechnology and Bioengineering，2008，1(99):108-116．