王振普 赤峰市農(nóng)牧業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊(duì) 024000

旋毛蟲病（Trichinelliasis）是一種由旋毛蟲引起的呈全球性分布的人獸共患寄生蟲病，可感染人及150 多種動物，現(xiàn)今該病仍有暴發(fā)流行［1］。在我國，其不但被列為三大人獸共患寄生蟲病之首（旋毛蟲病、囊蟲病及棘球蚴?。沂侨忸愡M(jìn)出口和屠宰動物首檢和必檢的一項(xiàng)［2］。我國于1981年首次在廈門從豬的體內(nèi)發(fā)現(xiàn)旋毛蟲，以后陸續(xù)在黑龍江、遼寧、福建、貴州、河南和湖北等省發(fā)現(xiàn)多種動物感染。

自從1835年P(guān)age 和Owen 首次發(fā)現(xiàn)旋毛蟲以來，人們始終在為有效快捷地診斷及預(yù)防旋毛蟲病做著不懈的努力［3］。旋毛蟲傳播途徑復(fù)雜，發(fā)育過程中不需要中間宿主，給該病的防制帶來極大的障礙。由于旋毛蟲的抗原成分極其復(fù)雜，而且不能進(jìn)行體外大量培養(yǎng)和繁殖，這給尋找特異、敏感的診斷抗原帶來困難，用于免疫預(yù)防的強(qiáng)保護(hù)性抗原問題始終未得到解決。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展和對旋毛蟲研究的不斷深入，使得研究旋毛蟲功能性基因成為可能。目前，對旋毛蟲侵入機(jī)體并調(diào)整肌細(xì)胞分化形成包囊的分子水平作用機(jī)制仍然知之甚微，由于新生幼蟲期是旋毛蟲包囊形成的主要時(shí)期，因此分離與鑒定旋毛蟲新生幼蟲期特異性基因，為進(jìn)一步探求旋毛蟲形成包囊的分子作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。核酸酶（nuclease）是指所有可以水解核酸中磷酸二酯鍵的酶的統(tǒng)稱。根據(jù)作用底物不同，可將核酸酶分為核糖核酸酶（RNase）和脫氧核糖核酸酶（DNase）；根據(jù)催化部位不同，可分為核酸外切酶(exonuclease)和核酸內(nèi)切酶(endonuclease)。

哺乳動物細(xì)胞內(nèi)存在多種脫氧核糖核酸內(nèi)切酶，一般該類酶以Ca2+、Mg2+為輔離子，在核苷酸內(nèi)部位點(diǎn)上裂解染色體DNA，形成特異性梯狀(ladder pattern)排列的片段，從而在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮一定作用。目前得到鑒定和公認(rèn)的核酸內(nèi)切酶主要有兩種：(1)脫氧核糖核酸酶I(deoxyribonu clease I，EC)，簡稱DNase I；(2)脫氧核糖核酸酶II(deoxyribonuclease II，EC)，簡稱DNase II。20世紀(jì)60年代末，首先在牛胰腺中發(fā)現(xiàn)DNase I(最初命名為胰DNase)，隨后在牛脾和胸腺中發(fā)現(xiàn)了DNase II（命名為脾酸性DNase）。兩者的主要區(qū)別是最佳pH 值和陽離子依賴程度不同。前者一般需要二價(jià)陽離子作為輔助因子，在接近中性條件下活性最高，而后者不需要二價(jià)陽離子作為輔助因子，在酸性條件下酶活性較高。

旋毛蟲的p43 基因編碼的蛋白為脫氧核糖核酸酶Ⅱ。而香港大學(xué)的KoRC 教授發(fā)現(xiàn)旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌物中具有很強(qiáng)的核酸酶活性，而偽旋毛蟲則沒有此酶活性（偽旋毛蟲是旋毛蟲中不能夠形成包囊的蟲種），并且進(jìn)一步驗(yàn)證了核酸酶參與了包囊形成的可能性［4］。因此，本文就旋毛蟲的脫氧核糖核酸酶研究做一綜述。

1 旋毛蟲DNaseⅡ的研究進(jìn)展

郭恒等［5］用地高辛標(biāo)記cDNA 探針N5 對旋毛蟲新生幼蟲(NBL)cDNA 文庫進(jìn)行核酸雜交篩選，有13 種基因均為旋毛蟲未知基因序列，均含有DNase II 的保守序列。隨后利用同樣的方法又從旋毛蟲成蟲（AD）的cDNA 文庫中調(diào)取了11 條DNase II 基因。而在旋毛蟲肌幼蟲（ML）中也發(fā)現(xiàn)存在一種編碼DNase II 的p43 基因。目前從旋毛蟲中發(fā)現(xiàn)的DNase II 基因最多。旋毛蟲為何具有如此眾多的DNase II 基因，其意義和原因還不是很清楚。旋毛蟲DNase II 在進(jìn)化關(guān)系上與其他物種的DNase II 也有較大的區(qū)別：旋毛蟲DNase II基因家族形成了一個(gè)獨(dú)特的分枝，而其他物種的DNase II 則在一個(gè)大的分枝內(nèi)。線蟲(如C.elegans，細(xì)胞凋亡機(jī)制和RNAi 的發(fā)現(xiàn)均源于它)作為一種模式生物已受到廣泛的重視和利用，故對旋毛蟲DNase II 進(jìn)行研究也同樣具有著非常重要的意義。DNase II 引發(fā)細(xì)胞凋亡的機(jī)理在于其對染色體DNA 進(jìn)行特異性切割致使細(xì)胞發(fā)生凋亡。旋毛蟲脫氧核糖核酸酶II 沒有引起肌細(xì)胞的凋亡，而是引發(fā)了肌細(xì)胞膠原蛋白基因的異常轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，從而有可能形成了旋毛蟲的膠原蛋白包囊。如果說旋毛蟲DNase II 以發(fā)揮切割DNA 的功能參與旋毛蟲包囊形成的話，那么可能的機(jī)制就是旋毛蟲通過一種或數(shù)種DNase II 對肌細(xì)胞的染色體DNA 進(jìn)行有目標(biāo)的特異性切割，切割的結(jié)果是使膠原蛋白基因得以保留而使其他基因遭到破壞，從而使膠原蛋白基因得以被大量轉(zhuǎn)錄與表達(dá)［6］。

對旋毛蟲N5 蛋白的活性中心和關(guān)鍵氨基酸殘基推測可能是正確的。證實(shí)N5 蛋白能夠被ATA抑制，在沒有鎂離子的條件下，突變產(chǎn)物同樣不能對DNA 進(jìn)行酶切，DNaseⅡ在pH 為5.0 左右時(shí)活性最大。旋毛蟲的DNaseⅡ活性區(qū)域是JFWLVH，關(guān)鍵氨基酸是H，人的DNaseII 活性區(qū)域是DHSKW，關(guān)鍵氨基酸是H。兩個(gè)區(qū)域在不同物種都非常保守。通過對旋毛蟲N5 蛋白進(jìn)行酶切實(shí)驗(yàn)，證實(shí)N5具有和DNaseII 同樣的特征。

DNase II 基因也有一定的相似性［7］，可以認(rèn)定p43 蛋白屬于DNaseII 家族成員。p43cDNA 與旋毛蟲新生幼蟲DNaseII 家族中的13 條基因氨基酸有較高的相似性，而與分離的旋毛蟲成蟲期DNase II家族的11 條基因也有較高的相似性。目前在旋毛蟲中發(fā)現(xiàn)的屬于脫氧核糖核酸酶II 的基因主要有如下幾種：肌幼蟲的p43（偽旋毛蟲為p38），成蟲的T3223 家族（代表性基因?yàn)門3223），新生幼蟲的N5 家族（代表性基因?yàn)镹5 和N10）。經(jīng)過基因庫的檢索與查詢，在目前已分離到DNase II 基因的38 個(gè)物種中，除旋毛蟲外任何一個(gè)物種均不具有超過4 種以上的DNase II 基因，而唯獨(dú)旋毛蟲卻擁有一個(gè)龐大的基因家族，雖然目前尚不知它們的具體功能，但很有可能與其侵襲與致病有關(guān)［8-11］。

p43 氨基酸序列中存在兩個(gè)糖基化位點(diǎn)，表明該p43 蛋白中存在糖基化現(xiàn)象。1996年Vassilatis發(fā)現(xiàn)抗43kDa 蛋白的抗體只有在去糖基化形式下才能識別保護(hù)性肽鏈，認(rèn)為碳水化合物覆蓋了抗原決定簇某些部分，因此糖基化反應(yīng)通過隱藏功能對相關(guān)抗原決定簇起作用，能構(gòu)成一個(gè)免疫系統(tǒng)的侵襲機(jī)制［12］。p43 蛋白是用于疾病診斷和免疫的重要物質(zhì)，碳水化合物是旋毛蟲的免疫顯性抗原決定簇，有關(guān)抗原決定簇或寄生蟲侵襲機(jī)制以及聚糖的作用等問題，還需進(jìn)一步研究。

從進(jìn)化結(jié)果來看，p43 基因與美國學(xué)者發(fā)現(xiàn)的p43 和p49 同源性最高，可以進(jìn)一步確定這三個(gè)基因是同一個(gè)基因。同時(shí)發(fā)現(xiàn)p43 與新生幼蟲期的DNaseII 的同源性要比成蟲期的DNaseII 高一些。而且發(fā)現(xiàn)旋毛蟲的DNaseII 序列都存在于一個(gè)大的分支內(nèi)，與其他物種的DNaseII 基因構(gòu)成了DNaseII基因進(jìn)化樹的兩個(gè)獨(dú)立的分支，其真實(shí)性和原因及意義有待進(jìn)一步研究。

2 結(jié)語

旋毛蟲DNase II 不但在包囊形成過程中起重要作用，而且還具有參與細(xì)胞凋亡，阻止外源基因整合的作用。對于旋毛蟲DNase II 家族的其他功能和意義還不清楚，需進(jìn)一步研究。

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