常 亮，魏增輝，李敏娜，梁 冬，仲偉潭

（微生物藥物國(guó)家工程研究中心 河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司，河北 石家莊050015）

達(dá)托霉素是一種新型的環(huán)脂肽類抗菌素，具有獨(dú)特的抗菌機(jī)制。達(dá)托霉素由連接到一個(gè)環(huán)狀13－氨基酸肽的N－末端色氨酸上的癸?；鶄?cè)鏈構(gòu)成，其中肽環(huán)或羧酸肽環(huán)是由氨基酸和非蛋白質(zhì)源氨基酸通過酰胺鍵或酯鍵構(gòu)成的［1］。由于脂鏈和疏水性基團(tuán)的存在，達(dá)托霉素具有一定的脂溶性，容易與細(xì)菌磷脂層反應(yīng)，因而具有良好的抗菌效果。

達(dá)托霉素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，穩(wěn)定性差，制備非常困難。國(guó)外采用微生物發(fā)酵法，通過離子交換樹脂以及疏水介質(zhì)提純達(dá)托霉素［2］，國(guó)內(nèi)中科院上海有機(jī)化學(xué)研究所采用固相合成方法首次化學(xué)合成達(dá)托霉素［3］，福建微生物研究所通過化學(xué)半合成工藝路線開發(fā)達(dá)托霉素［4］。上述工藝路線復(fù)雜、周期長(zhǎng)、成本高、產(chǎn)量低，距離產(chǎn)業(yè)化仍有一段距離。文獻(xiàn)［2］報(bào)道，達(dá)托霉素在pH值較低情況下，可形成膠束狀態(tài)。作者利用這一特性，采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)達(dá)托霉素，將達(dá)托霉素富集到菌絲體，對(duì)從發(fā)酵液中提取達(dá)托霉素粗品的工藝條件進(jìn)行了研究。

1 實(shí)驗(yàn)

1．1 試劑與儀器

達(dá)托霉素發(fā)酵液為華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司提供。

磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、鹽酸、珍珠巖、正丁醇均為國(guó)產(chǎn)分析純。

雙量程電子天平、FE20型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，梅特勒－托利多儀器上海有限公司；LC－2010AHT型高效液相色譜儀，Shimadzu；TGL－16G型高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1．2 方法

用1mol·L－1鹽酸調(diào)節(jié)達(dá)托霉素發(fā)酵液為酸性，離心分離后的澄清濾液幾乎檢測(cè)不到達(dá)托霉素，收集富含達(dá)托霉素的菌絲體；對(duì)菌絲體進(jìn)行浸泡，加入正丁醇萃取轉(zhuǎn)相；收集正丁醇萃取溶液，加入丙酮，結(jié)晶、干燥，制得達(dá)托霉素粗品。

對(duì)比不同溶劑、不同pH值緩沖溶液對(duì)菌絲體的浸提效果；同時(shí)對(duì)達(dá)托霉素的結(jié)晶條件進(jìn)行研究，以優(yōu)化適合工業(yè)化的提取工藝路線。

2 結(jié)果與討論

2．1 溶劑對(duì)浸提效果的影響

2．1．1 溶劑的選擇

達(dá)托霉素偏酸性，在中性pH值下分子帶負(fù)電荷，因而具有極好的水溶性。根據(jù)此特性，實(shí)驗(yàn)選擇pH值7．0的緩沖溶液以及不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇、甲醇對(duì)菌絲體進(jìn)行浸泡。

取達(dá)托霉素發(fā)酵液5L，調(diào)節(jié)pH值為3．0，離心分離得菌絲體。取菌絲體，均勻分為4份，以等體積的不同溶劑浸泡菌絲體30min，離心分離收集上清液，測(cè)定達(dá)托霉素濃度，計(jì)算浸提收率，結(jié)果見表1。

由表1可知，60%乙醇以及40%甲醇對(duì)菌絲體的浸提收率較高?？紤]使用溶媒對(duì)環(huán)境的污染以及工業(yè)化生產(chǎn)成本問題，確定選用緩沖溶液作為溶劑。

表1 不同溶劑浸提菌絲體的效果對(duì)比Tab．1 Comparison of extraction efficiency for different solvents

2．1．2 不同pH值緩沖溶液對(duì)浸提效果的影響

取達(dá)托霉素發(fā)酵液3L，調(diào)節(jié)pH值，離心分離菌絲體，用不同pH值的等體積的緩沖溶液浸泡1h，離心分離收集上清液，測(cè)定達(dá)托霉素濃度，計(jì)算一次浸提收率；將上述離心分離所得菌絲體再浸泡1h，離心分離，測(cè)定上清液中達(dá)托霉素濃度，計(jì)算二次浸提收率。結(jié)果見表2。

表2 不同pH值緩沖溶液對(duì)菌絲體的浸提效果對(duì)比／%Tab．2 Comparison of extraction efficiency for buffer solution with different pH values／%

由表2可知，pH值6．5～7．5的緩沖溶液對(duì)達(dá)托霉素浸提效果均較好。因此，確定適宜的緩沖溶液pH值為6．5～7．5。

2．2 結(jié)晶條件的確定

在接近等電點(diǎn)時(shí)，達(dá)托霉素轉(zhuǎn)入正丁醇相，同時(shí)可去除部分色素及雜蛋白。按照1．2方法制備達(dá)托霉素粗品，測(cè)定不同達(dá)托霉素的結(jié)晶條件（丙酮加量、結(jié)晶方式）下所制備的達(dá)托霉素粗品的質(zhì)量和收率，結(jié)果見表3。

表3 不同結(jié)晶條件下達(dá)托霉素粗品的質(zhì)量和收率Tab．3 Quality and yield of daptomycin crude under different crystallization conditions

由表3可知，隨著丙酮加入量的增加，結(jié)晶收率相應(yīng)提高，但丙酮加入量過多，會(huì)影響雜質(zhì)的去除效果，粗品純度有所下降。冷藏結(jié)晶較常溫結(jié)晶對(duì)達(dá)托霉素雜質(zhì)有更好的去除作用。因此，確定適宜的達(dá)托霉素結(jié)晶條件為以5～8BV丙酮冷藏結(jié)晶。

3 結(jié)論

確定了從發(fā)酵液中提取達(dá)托霉素的工藝條件為：調(diào)節(jié)達(dá)托霉素發(fā)酵液為酸性，對(duì)分離的菌絲體采用pH值6．5～7．5的緩沖溶液浸提，加入正丁醇進(jìn)行萃取使達(dá)托霉素轉(zhuǎn)相，收集正丁醇萃取溶液加入5～8 BV丙酮進(jìn)行冷藏結(jié)晶，干燥后制得達(dá)托霉素粗品。該工藝路線簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

［1］史麗娟，石磊．新型抗革蘭陽(yáng)性菌藥物——達(dá)托霉素［J］．中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)刊，2008，10（7）：1100－1101．

［2］T·J·凱萊赫，賴正吉，J·P·德庫(kù)西，等．高純度脂肽、脂肽膠束及其制備方法［P］．CN 1 404 487A，2003－03－19．

［3］徐紅巖，陸婷婷．一種達(dá)托霉素的合成方法［P］．CN 101 235 080A，2008－08－06．

［4］鄭衛(wèi)，程元榮，周劍，等．一種流加癸酸鹽發(fā)酵達(dá)托霉素的方法［P］．CN 101 880 703A，2010－11－10．