周 亮，陳 靜

（1．湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧437100；2．湖北科技學(xué)院核技術(shù)與化學(xué)生物學(xué)院，湖北 咸寧437100）

血清白蛋白是血漿中含量最豐富的重要載體蛋白。藥物進(jìn)入體內(nèi)后都是通過與血清白蛋白的結(jié)合、運(yùn)輸?shù)竭_(dá)受體部位而發(fā)揮藥效的。因此，研究藥物小分子與蛋白質(zhì)的相互作用對于了解藥物在體內(nèi)如何儲存、運(yùn)輸進(jìn)而發(fā)生藥理作用具有重要的意義［1－6］。

噻吩并嘧啶酮類化合物是一類具有良好生物活性和藥理活性的雜環(huán)化合物，有些具有良好的抗濾過性病原體、抗驚厥、殺菌及除草等生物活性，還有些可以用作鎮(zhèn)定劑［7，8］。作者合成了3－苯基－2－（4－叔丁基苯氧基）－3′－氧環(huán)己烷并噻吩并［2，3－d］嘧啶－4（3 H）－酮（PTP），并采用紫外吸收光譜法和熒光光譜法，在生理?xiàng)l件下研究了不同溫度下PTP與牛血清白蛋白（BSA）的相互作用，考察了PTP對BSA構(gòu)象的影響，為進(jìn)一步研究PTP的藥物作用機(jī)理及藥物開發(fā)提供了重要信息。PTP的分子結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 PTP的分子結(jié)構(gòu)Fig．1 The molecular structure of PTP

1 實(shí)驗(yàn)

1．1 試劑與儀器

牛血清白蛋白（BSA，中國科學(xué)院化學(xué)研究所）溶解在Tris－HCl（0．05mol·L－1Tris＋0．10mol·L－1NaCl，pH＝7．4）緩沖溶液中，BSA溶液在實(shí)驗(yàn)前15 min配制；其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

BS124S型電子分析天平，北京賽多利斯；PHS－3C型pH計(jì)，江蘇江分；UV－2300型紫外可見分光光度計(jì)、F－4500型熒光分光光度計(jì)（帶恒溫系統(tǒng)），日本日立。

1．2 PTP的合成

向干燥的50mL圓底燒瓶中加入1．461g（3mmol）膦亞胺，再加入約10mL四氫呋喃使其溶解，并快速加入等摩爾的芳基異氰酸酯，密閉于冰箱干燥器中靜置8h或12h，所得碳二亞胺無需純化，直接在攪拌下加入到溶有3mmol酚和一定量的固體碳酸鉀的四氫呋喃溶液中，40～45℃下攪拌過夜，過濾，減壓蒸去溶劑，殘余物以乙醇和二氯甲烷重結(jié)晶，得到2－芳氧基吡喃并噻吩并嘧啶酮衍生物PTP。

1．3 熒光光譜測試

以DMF為溶劑配制濃度為5．0×103mol·L－1的PTP儲備液以及不同溫度（T＝298K、302K、306 K、310K）下pH＝7．4的Tris－HCl緩沖溶液。

在1cm的比色皿中加入2mL濃度為1×10－5mol·L－1的BSA溶液，以λ＝295nm激發(fā)，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均為5nm，測定熒光光譜。然后逐次加入2μL PTP，測定系列溶液在不同溫度下300～500nm的熒光光譜。

2 結(jié)果與討論

2．1 PTP的波譜數(shù)據(jù)

IR（KBr），ν，cm－1：1698（C＝O），1602（C＝N），1572、1556、1497、1444（C＝C），1260（C－N），1219（C－O－C）。

1HNMR（300MHz，CDCl3），δ：1．29（s，9H，3CH3）；3．08（2H，CH2）；4．00（s，2H，CH2）；4．76（s，2H，CH2）；7．05（m，9H，C6H5，C6H4）。

MS，m／z，%：432（60）［M＋］，346（17），283（29），257（38），253（59），227（100），181（58），119（41），77（31）。

2．2 熒光光譜分析

BSA分子中含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基，因而具有內(nèi)源性熒光。當(dāng)激發(fā)波長為295nm時，BSA熒光發(fā)射峰位置在346nm附近；以同樣激發(fā)波長激發(fā)5．0×103mol·L－1PTP溶液，在346nm附近沒有熒光。這證明PTP不會產(chǎn)生與BSA相互干擾的熒光。298K下，保持BSA濃度不變、加入不同濃度的PTP，BSA的熒光光譜見圖2。

圖2 不同濃度PTP存在下BSA的熒光光譜Fig．2 The fluorescence spectra of BSA in the presence of different concentrations of PTP

從圖2可以看出，隨著PTP濃度的增大，BSA的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度有規(guī)律地降低，說明PTP能夠猝滅BSA的熒光，兩者之間存在著相互作用。

2．3 猝滅機(jī)理的推斷

引起B(yǎng)SA熒光猝滅的機(jī)理通常為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種類型。動態(tài)猝滅是猝滅劑分子與熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移或電子轉(zhuǎn)移，生成瞬時的激發(fā)態(tài)復(fù)合物，從而引起熒光猝滅。動態(tài)猝滅常數(shù)會隨著溫度的升高而增大。其過程遵循Stern－Volmer方程［9］：

式中：F、F0分別為有、無猝滅劑時的熒光強(qiáng)度；Kq為雙分子猝滅過程的速率常數(shù)；KSV為Stern－Volmer猝滅常數(shù)；τ0為猝滅劑不存在時生物大分子的平均壽命，約為10－8s；［Q］為猝滅劑濃度。通常各類熒光猝滅劑對生物大分子的最大動態(tài)猝滅速率常數(shù)為2．0×1010L·mol－1·s－1。

根據(jù)Stern－Volmer方程，繪制不同溫度下（T＝298K、302K、306K 和310K）的［（F0／F）－1］～［Q］曲線，見圖3。

圖3 不同溫度下PTP對BSA熒光猝滅的Stern－Volmer曲線Fig．3 Stern－Volmer plots for fluorescence quench of BSA by PTP at different temperatures

依據(jù)圖3中猝滅曲線的斜率求得298K、302K、306K和310K時的熒光猝滅常數(shù)KSV分別為1．115×105L·mol－1、1．012×105L·mol－1、0．986×105L·mol－1、0．837×105L·mol－1。可以明顯看出猝滅常數(shù)是隨著溫度的升高而減小的，表明PTP對BSA的熒光猝滅應(yīng)為靜態(tài)猝滅機(jī)理。進(jìn)一步求得298K、302K、306K、310K下的猝滅速率常數(shù)Kq分別為1．115×1013L·mol－1·s－1、1．012×1013L·mol－1·s－1、0．986×1013L·mol－1·s－1、0．837×1013L·mol－1·s－1。均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于2．0×1010L·mol－1·s－1，再次說明引起B(yǎng)SA溶液體系熒光猝滅的主要原因是靜態(tài)猝滅。

2．4 作用力類型的確定

PTP與BSA的靜態(tài)猝滅作用可以用Lineweaver－Burk雙倒數(shù)函數(shù)方程進(jìn)行描述：

式中：KLB為靜態(tài)熒光猝滅的結(jié)合常數(shù)，用來描述靜態(tài)猝滅過程中猝滅劑與生物大分子的結(jié)合反應(yīng)達(dá)到平衡時的量效關(guān)系。

繪制（F0－F）－1～［Q］－1曲線，依據(jù)其斜率和截距求出KLB的值，并進(jìn)一步求出熱力學(xué)參數(shù)ΔHθ、ΔGθ、ΔSθ，見表1。

表1 不同溫度下PTP與BSA相互作用的Lineweaver－Burk線性回歸方程、結(jié)合常數(shù)KLB、熱力學(xué)參數(shù)Tab．1 Binding constant KLB，Lineweaver－Burk linear regression equation and thermodynamic parametersfor interaction between PTP and BSA at different temperatures

在靜態(tài)猝滅過程中，靜態(tài)猝滅熒光強(qiáng)度與猝滅劑之間的關(guān)系可由熒光－猝滅劑分子間的表觀結(jié)合常數(shù)表達(dá)式導(dǎo)出［8］：

式中：Ka為猝滅劑與BSA之間的表觀結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

從表1可以看出，KLB的數(shù)值較大，表明PTP和BSA之間存在著較強(qiáng)的相互作用，且KLB隨著溫度的升高而減小。

根據(jù)反應(yīng)前后熱力學(xué)焓變ΔHθ和熵變ΔSθ的相對大小，可以判斷藥物分子與蛋白質(zhì)之間的主要作用力類型：ΔHθ＜0、ΔSθ＜0時，為范德華力和氫鍵；ΔHθ≈0、ΔSθ＞0時，為靜電引力；ΔHθ＞0、ΔSθ＞0時，為疏水作用力。從表1可以看出，PTP與BSA的相互作用是自發(fā)的（ΔGθ＜0），且ΔHθ＜0、ΔSθ＜0，可以認(rèn)為PTP與BSA之間的作用力主要是范德華力和氫鍵［10］。

2．5 表觀結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的計(jì)算

表2 不同溫度下的表觀結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)Tab．2 Binding constant Kaand the number of binding site at different temperatures

從表2可以看出，在不同溫度下（pH＝7．4），PTP與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n均接近1，說明PTP與BSA形成1個結(jié)合位點(diǎn)；Ka隨著溫度的升高逐漸增大，說明PTP與BSA形成了比較穩(wěn)定的終合物［11］。

2．6 結(jié)合距離的計(jì)算

根據(jù)Fster的無輻射能量轉(zhuǎn)移理論，能量轉(zhuǎn)移效率E與供體－受體間距離r、臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0之間有如下關(guān)系式［12］：

式中：R0為轉(zhuǎn)移效率為50%時的臨界距離。R0可由下式求出：

式中：K2為偶極空間取向因子；n為介質(zhì)的折射指數(shù)；Φ為供體的熒光量子產(chǎn)率；J為供體的熒光發(fā)射光譜與受體吸收光譜的光譜重疊積分，即：

式中：F（λ）為熒光受體在波長λ處的熒光強(qiáng)度；ε（λ）為受體在波長λ處的摩爾吸光系數(shù)。

PTP與BSA的摩爾比為1∶1時，PTP的紫外吸收光譜與BSA熒光光譜的重疊見圖4。

圖4 PTP吸收光譜（a）與BSA熒光光譜（b）的重疊Fig．4 Overlap of PTP absorption spectrum（a）and BSA fluorescence spectrum（b）

依據(jù)圖4中的光譜重疊部分按式（6）求出J。在上述條件下，取向因子取供體－受體各項(xiàng)隨機(jī)分布的平均值，即K2＝2／3；折射指數(shù)取水和有機(jī)物的平均值，即n＝1．36；BSA中色氨酸殘基的熒光量子產(chǎn)率Ф＝0．15；通過計(jì)算機(jī)輔助計(jì)算，求得PTP與BSA內(nèi)氨基酸殘基分子間的距離r＝1．78nm，符合能量轉(zhuǎn)移理論。這就表明PTP與BSA是足夠靠近的（r＜8nm），兩者之間是通過非輻射能量轉(zhuǎn)移的結(jié)合。

2．7 PTP對BSA構(gòu)象的影響

采用同步熒光光譜法，固定BSA的濃度、逐漸增大PTP的濃度，記錄Δλex＝15nm和Δλex＝60nm 時的同步熒光光譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酪氨酸殘基和色氨酸殘基的最大發(fā)射波長基本不變，說明PTP的加入并未使BSA的構(gòu)象發(fā)生明顯的改變。

3 結(jié)論

通過Aza－Wittig反應(yīng)，碳二亞胺與酚類化合物在堿性催化條件下成環(huán)，合成3－苯基－2－（4－叔丁基苯氧基）－3′－氧環(huán) 己 烷 并 噻 吩 并 ［2，3－d］嘧 啶 －4（3 H）－酮（PTP）。采用紫外吸收光譜法、熒光光譜法研究了PTP與BSA之間的相互作用，并考察了PTP的加入對BSA構(gòu)象的影響。結(jié)果表明，PTP對BSA的熒光猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅過程，PTP與BSA的結(jié)合反應(yīng)為自發(fā)進(jìn)行，反應(yīng)中主要作用力是氫鍵和范德華力，兩者的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1、結(jié)合距離為1．78nm，PTP的加入對BSA構(gòu)象沒有明顯影響。對進(jìn)一步探索PTP在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用有著重要參考價值。

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