王 輝，陳世杰，楊貴國，任風(fēng)芝，張雪霞

（1．河北食品添加劑有限公司，河北 石家莊050035；2．華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司微生物藥物國家工程研究中心，河北 石家莊050015）

姜黃素是從姜黃屬植物姜黃、郁金、莪術(shù)等的塊莖中提取出來的一種酚性色素，由3種活性單體成分姜黃素（姜黃素I）、脫甲氧基姜黃素（姜黃素Ⅱ）和雙脫甲氧基姜黃素（姜黃素Ⅲ）組成［1］，所占比例分別為40%、25%和35%，具有抗炎、抗氧化、清除自由基、抗腫瘤、降脂、抗菌等多種生物活性［2］。姜黃素是聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）規(guī)定的使用安全性很高的天然植物色素之一。研究發(fā)現(xiàn)雙脫甲氧基姜黃素的抗腫瘤活性最強(qiáng)，優(yōu)于脫甲氧基姜黃素及姜黃素［3－7］。然而，由于雙脫甲氧基姜黃素單體難于純化，目前國內(nèi)外尚無純度90%以上雙脫甲氧基姜黃素產(chǎn)品的規(guī)?；a(chǎn)和銷售。

作者在此對大孔樹脂分離純化雙脫甲氧基姜黃素的工藝進(jìn)行了研究，擬為雙脫甲氧基姜黃素的規(guī)模化制備及應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1．1 試劑與儀器

大孔樹脂HZ801和HZ816，上海華震科技有限公司；大孔樹脂D101和HP20，北京慧德易科技有限責(zé)任公司；大孔樹脂XAD1600，羅門哈斯公司；姜黃素油樹脂（雙脫甲氧基姜黃素含量12．1%），自制；色譜純乙腈，Merck公司；工業(yè)乙醇，滄州興隆化工有限公司；雙脫甲氧基姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品，上海江萊生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

中壓層析系統(tǒng)（C－601泵，C－615控制器，C－616收集器，C－635檢測器），瑞士Buchi公司；高效液相色譜儀（996檢測器，515泵），美國 Waters公司；Loborata 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，Heidolph公司。

1．2 HPLC檢測條件

色譜 柱：Hypersil C18（4．6mm×250mm，10μm）；流動相：乙腈－水－三氟乙酸（體積比55∶45∶1）；流速：1．0mL·min－1；檢測波長：420nm；進(jìn)樣量：20μL。

1．3 大孔樹脂的預(yù)處理與再生

取大孔樹脂 HZ801、HZ816、XAD1600、D101和HP20各500mL，用5BV工業(yè)乙醇浸泡12h后，濕法裝柱，繼續(xù)用乙醇洗至樹脂柱流出液加水后不渾濁；用水以3BV·h－1的流速沖洗樹脂柱，然后按2BV·h－1的流速注入2000mL 2%HCl溶液，浸泡2h后用水洗滌樹脂柱至流出液pH值為中性；再用2000mL 5%NaOH溶液按2BV·h－1的流速注入樹脂柱，浸泡2h，最后用水洗滌樹脂柱至流出液pH值為中性。

1．4 雙脫甲氧基姜黃素的分離純化

分別取預(yù)處理好的大孔樹脂 HZ801、HZ816、XAD1600、D101和 HP20各100mL，裝柱（2．5cm×30cm），用50%乙醇平衡系統(tǒng)。稱取1g姜黃素油樹脂，用2BV乙醇溶解后加樣于層析柱，先用2BV的50%乙醇洗滌，然后用一定濃度的乙醇洗脫，洗脫流速100mL·h－1，收集洗脫液，每管20mL。收集的洗脫液用HPLC檢測，將雙脫甲氧基姜黃素純度（面積歸一法，下同）大于90%的部分合并。減壓蒸餾除去乙醇后，水相用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相用無水硫酸鈉脫水后濃縮，稱重，計算收率。

2 結(jié)果與討論

2．1 大孔樹脂型號的選擇

不同型號大孔樹脂對雙脫甲氧基姜黃素洗脫收率的影響見圖1。

圖1 不同型號大孔樹脂對雙脫甲氧基姜黃素洗脫收率的影響Fig．1 Effect of different types of macroporous resin on elution yield of bisdemethoxycurcumin

從圖1可知，HZ801、XAD1600和HP20對雙脫甲氧基姜黃素都有比較好的層析效果，但XAD1600和HP20價格較高，因此選擇HZ801大孔樹脂作為層析填料。

2．2 洗脫條件的選擇

按照1．4方法，依次用50%乙醇、80%乙醇、90%乙醇各200mL梯度洗脫，不同濃度乙醇洗脫液中姜黃素單體的收率見表1。

表1 不同濃度乙醇洗脫液中姜黃素單體的收率／%Tab．1 The yield of each curcumin component in the eluents from different concentrations of ethanol／%

從表1可知，依次用50%乙醇、80%乙醇與90%乙醇梯度洗脫，可以得到純度大于90%的姜黃素Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。姜黃素Ⅰ和姜黃素Ⅱ主要集中在80%乙醇洗脫液中；姜黃素Ⅲ主要集中在90%乙醇洗脫液中，占全部乙醇洗脫液中總姜黃素Ⅲ的91．3%。故確定洗脫條件為：先用50%乙醇洗去極性大的雜質(zhì)，再用80%乙醇洗脫得到姜黃素Ⅰ和姜黃素Ⅱ，然后用90%乙醇洗脫得到純度大于90%、收率大于80%的姜黃素Ⅲ。

2．3 上樣量的選擇

分別稱取0．5g、1g、2g姜黃素油樹脂按照1．4方法吸附及洗脫，上樣量對姜黃素單體收率的影響見表2。

表2 上樣量對姜黃素單體收率的影響／%Tab．2 Effect of sample amount on yield of each curcumin component／%

從表2可知，上樣量為0．5g和1g時，各部分姜黃素單體收率均達(dá)到90%以上，交叉部分很少?？紤]到介質(zhì)載量及綜合生產(chǎn)成本，選擇1g上樣量，即姜黃素樣品的上樣量與HZ801大孔樹脂的質(zhì)量比為1∶100較為適宜。

2．4 結(jié)晶溶劑的選擇

合并雙脫甲氧基姜黃素純度大于90%的洗脫液，50℃減壓濃縮到20mL，分別加入等體積的異丙醇、三氯甲烷、丙酮溶劑，攪拌均勻，加熱溶解。然后靜置降溫，抽濾，得到結(jié)晶。HPLC檢測雙脫甲氧基姜黃素純度及收率，結(jié)果見表3。

表3 結(jié)晶溶劑對雙脫甲氧基姜黃素純度及收率的影響／%Tab．3 Effect of crystallization solvent on purity and yield of bisdemethoxycurcumin／%

從表3可知，以異丙醇為結(jié)晶溶劑可以得到純度92．8%的雙脫甲氧基姜黃素精粉，結(jié)晶收率72．6%，符合高端客戶要求。因此，選擇異丙醇作為結(jié)晶溶劑。

2．5 工藝驗(yàn)證

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇HZ801大孔樹脂為層析介質(zhì)，姜黃素樣品上樣量與樹脂的比例為1∶100，依次用50%乙醇、80%乙醇與90%乙醇梯度洗脫，HPLC在線檢測，收集純度大于90%的雙脫甲氧基姜黃素，減壓濃縮后加入等體積異丙醇結(jié)晶，進(jìn)行3批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表4 3批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果／%Tab．4The results of three validation experiments／%

從表4可知，3批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的分離純化效果均較好，雙脫甲氧基姜黃素純度大于90%、總收率大于60%。表明優(yōu)化工藝穩(wěn)定可靠。

3 結(jié)論

選用HZ801大孔樹脂作為層析介質(zhì)分離姜黃素粗提物，HPLC在線檢測，在上樣量為1g·100g－1填料，依次用50%乙醇、80%乙醇和90%乙醇梯度洗脫，異丙醇為結(jié)晶溶劑時，能夠得到純度大于90%、總收率大于60%的雙脫甲氧基姜黃素。該分離純化方法簡便可靠，適于工業(yè)化生產(chǎn)。

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