鄢 倩，張傳鵬，李富玉，李?；?，管華詩(shī)，劉紅兵

（1．中國(guó)海洋大學(xué)海洋藥物與食品研究所 海洋藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266003；2．濟(jì)南軍區(qū)青島第一療養(yǎng)院中醫(yī)科，山東 青島266003）

抗疲勞體能茶是以普洱茶為主，加以紅景天、淫羊藿等數(shù)味藥食兼用中藥提取物配制而成的茶劑，其主要功效成分是總黃酮，其中代表性的為紅景天苷和淫羊藿苷，應(yīng)作為產(chǎn)品質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。

作者首先以紅景天苷含量、淫羊藿苷含量和總黃酮含量為考核指標(biāo)，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、醇加量和提取時(shí)間為考察因素，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出3種抗疲勞體能茶功效成分的提取工藝；進(jìn)而利用小鼠游泳致疲勞模型，以小鼠負(fù)重游泳時(shí)間為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以確定最佳提取工藝。

1 實(shí)驗(yàn)

1．1 材料、試劑與儀器

普洱茶產(chǎn)自云南勐海。紅景天、淫羊藿等藥材（青島市同仁堂藥業(yè)有限公司），經(jīng)中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院劉紅兵副教授鑒定為《中國(guó)藥典》收載品種。

紅景天苷（批號(hào)11818－201005，含量99．9%）、淫羊藿苷 （批 號(hào) 110737－200415）、蘆丁 對(duì) 照品 （批 號(hào)100080－200707，含量92．5%），國(guó)家藥品與生物制品檢定所；乙腈（色譜純），山東禹王；液相用水為 Millipore雙蒸水；其它試劑均為分析純。

Agilent 1100型高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司；AL204－IC 型 電 子 天 平，上 海 梅 特 勒 公 司；KQ3200B型超聲清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；2800型紫外分光光度計(jì)，上海森信公司。

1．2 方法

1．2．1 正交實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取抗疲勞體能茶配方中藥9份，每份10．0 g，采用乙醇回流法提取2次。合并提取液，濾過(guò)，減壓濃縮至干，得中藥提取物。分別測(cè)定紅景天苷、淫羊藿苷、總黃酮的含量。并以其為考核指標(biāo)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、醇加量（B）、提取時(shí)間（C）為考察因素，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Tab．1 Factors and levels of orthogonal experiment

1．2．2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

利用小鼠游泳致疲勞模型、以小鼠負(fù)重游泳時(shí)間為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到的3種不同提取工藝（功效成分工藝A1B2C3、總黃酮工藝A3B3C3、綜合平衡工藝A1B3C3）進(jìn)行考察，以確定最佳提取工藝。

1．2．3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

SPF級(jí)昆明種小鼠，雄性，體重18～22g，標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)2d后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、功效成分組（工藝A1B2C3＋茶葉）、總黃酮組（工藝A3B3C3＋茶葉）、綜合平衡組（工藝A1B3C3＋茶葉）。提取物給藥劑量相當(dāng)于原配方生藥5g·kg－1，經(jīng)口給藥，灌胃容積0．02mL·g－1?？瞻讓?duì)照組給予等體積的蒸餾水。

1．2．4 小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的測(cè)試

根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003版）》測(cè)定小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間。每天給藥1次，連續(xù)給藥29d。末次給藥30min后，在小鼠尾根部負(fù)荷5%體重鉛絲置于游泳箱中游泳。水深不低于30cm，水溫（25±1．0）℃。參照MCARLE推薦的力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)（即小鼠頭部沉入水中，經(jīng)10s還不能返回水面視為力竭），記錄自游泳開始至力竭的時(shí)間，作為游泳時(shí)間。數(shù)據(jù)以均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。各組數(shù)據(jù)均進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間差異采用t檢驗(yàn)。

1．3 分析檢測(cè)

1．3．1 三氯化鋁－紫外可見分光光度法測(cè)定總黃酮含量

1．3．1．1 蘆丁對(duì)照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對(duì)照品5．0mg，以60%乙醇溶解并定容至25mL，得到濃度為185mg·L－1的蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備溶液；移取儲(chǔ)備液10mL至25mL容量瓶中，以60%乙醇定容，得到濃度為74mg·L－1的蘆丁對(duì)照品溶液。

1．3．1．2 供試品溶液的制備

精密稱取中藥提取物，以60%乙醇溶解并定容至10mL；移取1mL提取液于10mL容量瓶中，以60%乙醇定容，即得供試品溶液。

1．3．1．3 最大吸收波長(zhǎng)λmax的確定

分別移取1mL蘆丁對(duì)照品溶液和1mL供試品溶液至10mL容量瓶中，各加入2mL 0．1mol·L－1的三氯化鋁溶液，再以60%乙醇定容。室溫放置顯色20min后，以空白溶劑校正基線，在200～600nm波長(zhǎng)范圍掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)λmax。同時(shí)移取1mL供試品溶液于10mL容量瓶中，以60%乙醇定容，顯色20min后，在200～600nm波長(zhǎng)范圍掃描。結(jié)果表明，三氯化鋁顯色后的對(duì)照品和供試品溶液在417nm處均有最大吸收，而未經(jīng)三氯化鋁顯色的供試品在該處無(wú)吸收。

1．3．1．4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)方程的建立

分別移取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL蘆丁對(duì)照品溶液至10mL容量瓶中，各加入2mL 0．1 mol·L－1的三氯化鋁溶液，以60%乙醇定容。室溫放置顯色20min后，于417nm處測(cè)定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)、蘆丁濃度（c）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得回歸方程A＝0．0376c－0．0163（R2＝0．9992），蘆丁濃度在7．4～44．4mg·L－1范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

1．3．2 HPLC法同時(shí)測(cè)定紅景天苷和淫羊藿苷含量

1．3．2．1 對(duì)照品溶液的制備

稱取紅景天苷對(duì)照品12．6mg，以20%乙腈溶液溶解并定容至5mL，得2517．5mg·L－1的紅景天苷對(duì)照品儲(chǔ)備液；移取儲(chǔ)備液1mL，以20%乙腈溶液稀釋定容至2mL，得1259mg·L－1的紅景天苷對(duì)照品溶液。

稱取淫羊藿苷對(duì)照品9．5mg，以甲醇溶解并定容至5mL，得1900mg·L－1的淫羊藿苷對(duì)照品儲(chǔ)備液；移取儲(chǔ)備液1mL，以甲醇定容至2mL，得950mg·L－1的淫羊藿苷對(duì)照品溶液。

1．3．2．2 供試品溶液的制備

精密稱取中藥提取物，以20%乙腈溶液溶解并定容至2mL，于10 000r·min－1離心，取上清液，即得供試品溶液。

1．3．2．3 色譜條件

Waters Sunfire C18色譜柱（4．6mm×250mm，5μm），流動(dòng)相為水（A相）－乙腈（B相），采用梯度洗脫：0～6min，14%B；6～16min，14%～33%B；16～30 min，33%B。流速1mL·min－1，進(jìn)樣量10μL，檢測(cè)波長(zhǎng)270nm，柱溫35℃。在該色譜條件下，紅景天苷和淫羊藿苷能得到很好的分離，且在紅景天苷和淫羊藿苷的出峰位置，沒(méi)有其它色譜峰的干擾（圖1）。

1．3．2．4 標(biāo)準(zhǔn)方程的建立

吸取紅景天苷對(duì)照品溶液1mL，逐級(jí)稀釋至6個(gè)濃度，測(cè)HPLC圖譜。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)、濃度（c）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得紅景天苷線性回歸方程A＝2．042c－26．15（R2＝0．9998），線性范圍40～125 9mg·L－1。

同法，得淫羊藿苷線性回歸方程A＝9．056c－81．36（R2＝0．9998），線性范圍30～950mg·L－1。

2 結(jié)果與討論

2．1 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選提取工藝

正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析見表2。

圖1 供試品的HPLC圖譜Fig．1 The HPLC spectrum of Ti－neng Tea extract

表2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Tab．2 Results and analysis of orthogonal experiment

由表2可知，無(wú)論是以紅景天苷含量還是以淫羊藿苷含量為指標(biāo)，各因素影響均不顯著，最佳提取工藝均為A1B2C3；若以總黃酮含量為指標(biāo)，因素B對(duì)總黃酮含量有顯著影響，各因素影響主次為B＞A＞C，最佳提取工藝為A3B3C3；綜合直觀分析結(jié)果［1］，采用綜合平衡法［2－5］，考慮提取效率及提取成本，確定綜合平衡工藝為A1B3C3。

2．2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)確定最佳提取工藝

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)測(cè)試不同組別的小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，結(jié)果見表3。

由表3可知，各實(shí)驗(yàn)組都能極其顯著延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間（P＜0．01），其中以綜合平衡組（工藝A1B3C3＋茶葉）效果最好，其次是功效成分組。因此，確定抗疲勞體能茶功效成分的最佳提取工藝為A1B3C3，即用12倍量的50%乙醇回流提取2次，每次2．0h。

表3 不同組別小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的比較（X±s）Tab．3 Comparison of swimming time of mice with weight loading of different groups

3 結(jié)論

通過(guò)考察紅景天苷、淫羊藿苷、總黃酮的含量和藥效，多指標(biāo)優(yōu)選抗疲勞體能茶的功效成分提取工藝。正交實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)確定最佳提取工藝為：以12倍量的50%乙醇回流提取2次，每次2．0h。在此工藝條件下，抗疲勞體能茶不僅功效成分的含量較高，而且具有很好的抗疲勞作用。含量與藥效多指標(biāo)評(píng)判方法綜合考慮功效成分的提取效果和藥效，客觀、可靠，為中藥復(fù)方提取工藝的優(yōu)化研究提供了有益的參考。

［1］《正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法》編寫組．正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法［M］．上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979：1－63．

［2］胡建軍，周冀衡，柴家榮，等．多指標(biāo)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)的優(yōu)化分析及應(yīng)用［J］．中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2008，14（2）：9－14．

［3］劉蘭萍，段好剛，魏玉輝，等．多指標(biāo)綜合優(yōu)化疏乳消塊方的提取工藝［J］．中成藥，2012，34（12）：2318－2321．

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