歐陽蒲月，黃智璇

（廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州510520）

Toll樣受體家族（TLRs）蛋白均由富含亮氨酸（LRRs）的胞外區(qū)和包含 Toll／IL－1樣同源區(qū)（TIR）的胞內(nèi)區(qū)組成［1］。其中Toll樣受體5（TLR5）可在單核細胞、未成熟樹突狀細胞及上皮細胞中表達，是一種參與免疫應(yīng)答的受體，在人類和小鼠中其具體作用是識別鞭毛蛋白并激活 NF－κB 介導(dǎo)的免疫反應(yīng)［2］。TLR5和TLR4一起，可以識別鞭毛蛋白并激活干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF－3）［3］。在魚類中 TLR5是保守的，已經(jīng)在河豚（Fugu rubripes）、斑馬魚（Danio rerio）、虹鱒魚（Rainbow trout）中證實了 TLR5分子的存在［4］。

TLRs在魚類中的功能與在哺乳動物中有些差異：（1）在大部分的魚類中，不僅存在與人類同源的TLR5分子，還有一種哺乳動物中沒有的可溶的TLR5（TLR5S）；（2）TLR4在硬骨魚中并不是普遍存在的，有些魚類（如河豚）中就沒有TLR4；（3）有一些TLRs分子是魚類特有的，例如 TLR21、TLR22、TLR14，目前認為這同魚類特殊的生活環(huán)境有關(guān)［5］。

作者對硬骨魚類中的斑馬魚的TLR5在受到殺鮭氣單胞菌（革蘭氏陰性菌，G－）、金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽性菌，G＋）刺激之后的表達變化進行了研究，旨在探討TLR5對于斑馬魚天然免疫的重要意義。

1 實驗

1．1 實驗動物、菌株與引物

成體斑馬魚，野生型，實驗室繁殖一代以上。

殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida），金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。

TLR5 上 游 引 物：5′－CGAATCTCTTCAGCACCCTC－3′，TLR5下游引物：5′－CTGGCACACGTCACATCCTC－3′。

1．2 方法

1．2．1 感染用殺鮭氣單胞菌和金黃色葡萄球菌的準備

接種殺鮭氣單胞菌／金黃色葡萄球菌單克隆于5mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，28℃／37℃搖床培養(yǎng)過夜（8～10h）。再按1∶50的比例接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，放大培養(yǎng)至對數(shù)期（2～3h）。6000r·min－1離心收菌，用無菌的PBS重懸洗滌。最后溶于PBS至一定濃度。將菌液倍比稀釋后涂LB平板，計算菌落數(shù)，確定菌液終濃度。

1．2．2 斑馬魚感染

首先在斑馬魚培養(yǎng)液中添加丁香酚至160μg·mL－1進行麻醉，用無菌解剖刀刮傷斑馬魚側(cè)面胸鰭至真皮層（面積約1mm2）。

殺鮭氣單胞菌感染：將實驗組的斑馬魚放入200mL 1×106CFU·mL－1的殺鮭氣單胞菌溶液中浸泡（對照組為清水）15h，取實驗組和對照組斑馬魚（各3條）的內(nèi)臟組織混合提取RNA。

金黃色葡萄球菌感染：采用腹腔注射法。每條質(zhì)量約1g的斑馬魚注射3×106CFU·mL－1金黃色葡萄球菌。對照組注射50μL PBS。

1．2．3 實驗樣品的獲取

將感染后的斑馬魚作為實驗組，分別于1h、4h、15h、24h提取5條全魚的混合RNA，同時取相同時間點的未感染斑馬魚的RNA作為對照。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA一鏈作為RT－PCR的模板。

1．2．4 實時定量RT－PCR

總RNA的提取：按Trizol試劑盒說明書的步驟依次加入Trizol提取液、氯仿、異丙醇，提取總RNA。用紫外分光光度儀分別測定260nm和280nm處的光密度值，確定RNA含量和純度。

cDNA的合成：按TOYOBO產(chǎn)品說明書推薦的方法合成cDNA第一條鏈。在0．2mL EP管中分別加入總 RNA 3μg、Oligo（dT）18 50pmol、dNTP 20 nmol、5×緩沖溶液4μL、Rnasin 1μL、酶200μL（5U·μL－1）和DEPC水，反應(yīng)體系總體積為20μL。逆轉(zhuǎn)錄條件為：42℃1h，70℃10min。

PCR反應(yīng)體系為：cDNA 1．5μL，上、下游引物各5μL，QuantiTetTM SYBR Green PCR Kit提供的2× QuantiTetTM SYBR Green PCR Master Mix 12．5μL，用去離子水（ddH2O）將總體積補至25μL。在 ABIPRISM 7700（PE Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA）定量PCR儀上按以下條件擴增：95℃15s，58℃15s，72℃30s，共40個循環(huán)，同時記錄溶解曲線。

1．2．5 數(shù)據(jù)的收集及統(tǒng)計學(xué)的處理

每組擴增3個平行樣品，取平均值，根據(jù)內(nèi)參（β－Actin）消減試驗不平衡誤差，默認擴增效率統(tǒng)一為2，計算斑馬魚感染前后目的基因表達量的相對變化并繪制柱形圖。

2 結(jié)果與討論

2．1 PCR結(jié)果

斑馬魚感染殺鮭氣單胞菌（G－）、金黃色葡萄球菌（G＋）后TLR5表達的變化見圖1。

由圖1可知，斑馬魚感染G＋和G－細菌后，TLR5表達都不同程度出現(xiàn)了上調(diào)。斑馬魚感染殺鮭氣單胞菌后4h，TLR5表達開始出現(xiàn)上調(diào)，至15h達到峰值，升幅243．8倍（223．6～250），然后迅速回落。同樣，斑馬魚感染金黃色葡萄球菌后，TLR5表達上調(diào)更迅速，在4h即出現(xiàn)峰值，升幅208．3倍（189．7～226．9），隨后逐步回落。TLR5在人類和小鼠中都是識別鞭毛蛋白的模式受體，從本研究結(jié)果可以看出，G＋和G－細菌的感染都誘發(fā)了TLR5表達的上調(diào)，即使是完全沒有運動能力、不具有鞭毛的金黃色葡萄球菌也可以誘發(fā)TLR5表達的上調(diào)。

圖1 斑馬魚感染殺鮭氣單胞菌和金黃色葡萄球菌后TLR5的表達變化Fig．1 Change of expression of TLR5when zebrafish was infected with Aeromonas salmonicida（G－ ）and Staphylococcus aureus（G＋ ）respectively

2．2 討論

細菌根據(jù)革蘭氏染色結(jié)果的不同可以分為革蘭氏陽性菌（G＋）和革蘭氏陰性菌（G－），這兩類細菌結(jié)構(gòu)不同，作為感染源時的致病成分也不同，例如革蘭氏陰性菌的致病成分LPS在革蘭氏陽性菌中不存在，革蘭氏陽性菌主要是靠LTA來激活免疫反應(yīng)。

鞭毛蛋白是細菌鞭毛的主要組成部分，很多的病原微生物，包括大部分革蘭氏陰性菌和小部分革蘭氏陽性菌都具有鞭毛，雖然G＋和G－的鞭毛結(jié)構(gòu)有些細微的差別，但都能激活天然免疫反應(yīng)。研究證明TLR5可以通過識別恒定結(jié)構(gòu)域D1（位于蛋白中間部位的α螺旋鏈）來鑒別鞭毛蛋白。

殺鮭氣單胞菌是革蘭氏陰性菌，無芽孢，兼性厭氧桿菌，屬弧菌，主要引起魚類的癤瘡病，即體表皮膚出現(xiàn)癤瘡，癤瘡破皮而出形成潰瘍，解剖后可見典型的敗血癥癥狀。金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽性菌，是人類的一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬，可引起多種嚴重感染，有“嗜肉菌”的別稱，無芽孢、鞭毛，大多數(shù)無莢膜。

本研究發(fā)現(xiàn)，用具有鞭毛的殺鮭氣單胞菌感染斑馬魚后，可以使TLR5的表達量在感染后15h達到243．8倍的峰值，這說明TLR5在斑馬魚中也是識別鞭毛蛋白的。但是用不具有鞭毛的金黃色葡萄球菌感染斑馬魚后也可以誘發(fā)TLR5表達的上調(diào)。

考慮到斑馬魚的生存環(huán)境，頻繁接觸外源微生物，它需要強大的免疫系統(tǒng)來保護自己。目前已知魚類與哺乳動物在免疫系統(tǒng)上有很多差異，雖然斑馬魚屬于脊椎動物，已經(jīng)具備較為完善的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)和強大的固有性免疫系統(tǒng)，但是仍然存在很大的差距。例如，魚類非常重要的一點就是對于LPS不敏感。LPS是一種內(nèi)毒素，是細胞壁組分中最有效的免疫興奮劑。LPS的組成部分類脂A則是大部分G－細菌感染中出現(xiàn)的病理現(xiàn)象（如內(nèi)毒素性休克）的主要致病因子。在哺乳動物中，LPS侵入后可以與LPS結(jié)合蛋白（LBP）結(jié)合，募集CD14和MD－2，復(fù)合體能夠被TLR4識別，激活免疫信號［6，7］。但是魚類卻可以對LPS高度耐受，具體的原因至今仍在探索。另外魚類的Toll樣受體家族中也發(fā)現(xiàn)了不少在哺乳動物中不存在的新成員，如 TLR5S、TLR20、TLR21等等［5］，這也使得魚類的固有性免疫更加完善和強大。

魚類的致病菌大部分是革蘭氏陰性菌，這類細菌大多帶有鞭毛和LPS，魚類為了生存，對日常生活中過于頻繁接觸的LPS高度耐受，TLR5可能就是魚類抵抗革蘭氏陰性菌的核心策略。鞭毛的作用是為了細菌的運動，所以數(shù)量很少，大部分只有1～4根，數(shù)量有限，不像LPS那樣遍布細菌的整個細胞膜。具有鞭毛的革蘭氏陰性菌可以直接激活TLR5通路，從而幫助斑馬魚抵御革蘭氏陰性菌，又不至于引起過于激烈的免疫反應(yīng)。

因此認為TLR5是斑馬魚天然免疫防御的核心。不具有鞭毛的革蘭氏陽性菌可能是先激活Toll樣受體家族的其它通路，再誘導(dǎo)TLR5表達的活躍，協(xié)同抵御外源微生物的入侵。具體的調(diào)控機制尚需要進一步的研究。

3 結(jié)論

Toll樣受體家族（TLRs）在天然免疫中發(fā)揮著重要作用。用殺鮭氣單胞菌（革蘭氏陰性菌）和金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽性菌）分別感染斑馬魚后，檢測了斑馬魚TLR5表達的變化。結(jié)果表明，具有鞭毛的殺鮭氣單胞菌和不具有鞭毛的金黃色葡萄球菌均可以誘導(dǎo)TLR5表達的上調(diào)。認為具有鞭毛的殺鮭氣單胞菌可以直接激活TLR5通路，而不具有鞭毛的金黃色葡萄球菌可能是先激活了Toll樣家族的其它通路后再誘導(dǎo)TLR5表達的上調(diào)，從而推斷TLR5是斑馬魚天然免疫的核心。

［1］Akira S，Takeda K．Toll－like receptor signaling［J］．Nat Rev Immunol，2004，4（7）：499－511．

［2］Hayashi F，Smith K D，Ozinsky A，et al．The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll－like receptor 5［J］．Nature，2001，410（6832）：1099－1103．

［3］Mizel S B，Honko A N，Moors M A，et al．Induction of macrophage nitric oxide production by Gram－negative flagellin involves signaling via heteromeric Toll－like receptor 5／Toll－like receptor 4 complexes［J］．J Immunol，2003，170（12）：6217－6223．

［4］Tsujita T，Ishii A，Tsukada H，et al．Fish soluble Toll－like receptor（TLR）5amplifies human TLR5response via physical binding to flagellin［J］．Vaccine，2006，24（12）：2193－2199．

［5］Baoprasertkul P，Xu P，Peatman E，et al．Divergent Toll－like receptors in catfish （Ictalurus punctatus）：TLR5S，TLR20，TLR21［J］．Fish Shellfish Immunology，2007，23（6）：1218－1230．

［6］Poltorak A，He X，Smirnova I，et al．Defective LPS signaling in C3H／HeJ and C57BL／10ScCr mice：Mutations in Tlr4gene［J］．Science，1998，282（5396）：2085－2088．

［7］Shimazu R，Akashi S，Ogata H，et al．MD－2，a molecule that confers lipopolysaccharide responsiveness on Toll－like receptor 4［J］．J Exp Med，1999，189（11）：1777－1782．