張 旭，劉華晶，黃曉梅，李 倩，徐誠蛟

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030）

全球石油資源逐漸枯竭，纖維素作為地球上最為豐富的資源，卻沒有得到合理利用，反而造成了一定程度的環(huán)境污染。因此，對纖維素的可再生能源開發(fā)是世界性的重要課題。第二代生物燃料技術(shù)能夠以低成本的農(nóng)林業(yè)廢棄物以及木材加工廢料為原料，通過微生物降解纖維素來生產(chǎn)燃料乙醇。目前，纖維素燃料乙醇技術(shù)的發(fā)展十分迅速，是公認(rèn)的極有希望實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的生物質(zhì)能源技術(shù)，而提高纖維素酶對復(fù)雜纖維結(jié)構(gòu)的降解效率是其工業(yè)化的關(guān)鍵因素之一［1］。

長期以來，人們對纖維素降解酶的研究主要集中在木霉屬（Trichoderma）和曲霉屬（Aspergillus）等菌株，其中瑞氏木霉（T．reesei）及其變異菌株為高效產(chǎn)纖維素酶的代表菌株，而對青霉（Penicillium）纖維素降解酶系的研究相對較少。與瑞氏木霉相比較，青霉不僅能高效分泌β－葡萄糖苷酶（β－Glucosidase）［2］，而且擁有更全面的降解天然木質(zhì)纖維材料的酶系組分［3，4］。van Wyk［5］比較繩狀青霉（Penicillium funiculosum）與瑞氏木霉的胞外纖維素酶水解活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，在少數(shù)底物的降解中，繩狀青霉能夠得到更高濃度的葡萄糖。自Wood等［6］在20世紀(jì)80年代首先分離純化繩狀青霉的纖維二糖水解酶后，關(guān)于繩狀青霉纖維素降解酶系的純化與克隆的研究逐漸增多［7］，但對于繩狀青霉β－葡萄糖苷酶的研究仍相對較少。

作者以一株野生繩狀青霉為研究材料，經(jīng)離子交換層析與凝膠過濾層析，從粗酶液中初步分離純化出一種低分子量β－葡萄糖苷酶（EC 3．2．1．21），并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究。

1 實(shí)驗(yàn)

1．1 菌株與培養(yǎng)基

從常年堆放麩皮的倉庫取樣，分離得到一株青霉，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為繩狀青霉（Penicillium funiculosum），命名為P07M12。

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基（g·L－1）：葡萄糖 1．0，纖維素粉3．0，KH2PO42．5，（NH4）2SO41．5，MgSO4·7H2O 0．3，CaCl2·H2O 0．3，F(xiàn)eSO4·7H2O 0．0005，ZnSO4·7H2O 0．0015，蛋白胨2．5，酵母膏2．0，pH 值5．0。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g·L－1）：麩皮 10．0，乳糖 6．0，KH2PO43．0，MgSO4·7H2O 0．5，CaCl2·H2O 0．5。

1．2 試劑與儀器

DEAE－Sephadex A－25、Sephadex G－100、Sephadex G－50由Pharmacia公司進(jìn)口分裝；對硝基苯－β－D－吡喃半乳糖苷（pNPG）、纖維素粉、Tris堿、丙烯酰胺，Sigma公司；其它試劑為國產(chǎn)分析純。

Power Pac200 型 蛋 白 電 泳 儀，Bio－rad；Minifors型發(fā)酵罐，瑞士Infors公司；TU－1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；臺式高速離心機(jī)，上海飛鴿儀器廠；搖床，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；透析袋，Whatman；Alphalmager 2200型凝膠成像系統(tǒng)，Alpha Innotech Corporation；LKB－100型自動部分收集器，瑞典Pharmacia公司。

1．3 酶的分離純化

1．3．1 粗酶液制備

用接種環(huán)在斜面培養(yǎng)基上刮取少量孢子于無菌水中，制成孢子懸液，吸取5mL接種于100mL種子培養(yǎng)基中，于30℃、150r·min－1振蕩培養(yǎng)48h，然后以10%的接種量接入裝有1L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，于30℃深層發(fā)酵10d，將發(fā)酵液用8層滅菌棉紗過濾后，于4℃、8000r·min－1離心20min，取上清作為粗酶液待用。

1．3．2 硫酸銨粗提

粗酶液用飽和度20%～80%［8］的硫酸銨鹽析，對沉淀進(jìn)行分析，確定β－葡萄糖苷酶鹽析量最大時(shí)的硫酸銨飽和度。將硫酸銨鹽析溶液于4℃放置過夜，5000r·min－1離心10min，去上清，用適量pH值7．8的50mmol·L－1Tris－HCl緩沖溶液溶解沉淀，將粗酶液放入透析袋中，于4℃過夜，再加入適量聚乙二醇脫水濃縮。

1．3．3 DEAE－Sephadex A－25柱層析

將1．3．2濃縮酶液上樣到預(yù)先用pH值7．8的50 mmol·L－1Tris－HCl緩沖 溶 液 平 衡 好 的 DEAESephadex A－25離子交換層析柱上，用同一緩沖溶液配制NaCl梯度（0～0．3mol·L－1）洗脫液，以1mL·min－1的流速洗脫，收集洗脫液，用紫外分光光度計(jì)測定蛋白質(zhì)濃度與酶活力，合并高酶活力部分，用聚乙二醇除鹽濃縮。

1．3．4 Sephadex G－100柱層析

將1．3．3濃縮酶液上樣至預(yù)先用pH值4．8的50 mmol·L－1Tris－HCl緩沖溶液平衡好的Sephadex G－100凝膠過濾層析柱（1．6cm×100cm）上，用同一緩沖溶液洗脫，收集洗脫液，分別測定蛋白質(zhì)濃度與酶活力，合并高酶活力部分，濃縮，得純化酶液A，測定蛋白質(zhì)分子量。

1．3．5 Sephadex G－50柱層析

將1．3．3濃縮酶液上樣至預(yù)先用pH值5的50 mmol·L－1Tris－HCl緩沖溶液平衡好的Sephadex G－50凝膠過濾層析柱（1．6cm×100cm）上，洗脫液流速為0．5mL·min－1，收集洗脫液，測定蛋白質(zhì)濃度與酶活力，合并高酶活力部分，濃縮，得純化酶液B，測定蛋白質(zhì)分子量。

1．4 酶學(xué)性質(zhì)研究

1．4．1 最適反應(yīng)溫度的測定

將純化酶液適當(dāng)稀釋，分別在不同溫度環(huán)境（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）下，以活力最大值為100%，用pNPG法測定β－葡萄糖苷酶的相對酶活。

1．4．2 最適反應(yīng)pH值的測定

將純化酶液放入不同pH值環(huán)境［2．5～4．5（醋酸）、5．5～7．5（磷酸）、8．5（Tris－HCl）］中，以 pNPG為底物，于60℃反應(yīng)30min，測定相對酶活。

1．5 分析與檢測

1．5．1 酶活力的測定

用pNPG法測定酶活力［9］。以pNPG為底物，在pH值4．8的50mmol·L－1醋酸緩沖溶液中，于40℃水浴保溫反應(yīng)10min后，立即加入2mL 1mol·L－1Na2CO3溶液終止反應(yīng)，測定吸光值OD410，以對硝基酚的生成量表示酶活力。

1個(gè)酶活單位（IU）定義為：每分鐘每毫升酶液分解pNPG釋放1μmol對硝基酚所需的酶量。

1．5．2 蛋白質(zhì)濃度的測定

采用紫外吸收法測定蛋白質(zhì)濃度［10］。測定蛋白質(zhì)中酪氨酸與色氨酸殘基在280nm處的吸光值，從而獲取相應(yīng)溶液中蛋白質(zhì)的濃度。

1．5．3 蛋白質(zhì)分子量的測定

采用 SDS－PAGE凝膠電泳系統(tǒng)［11］測定β－葡萄糖苷酶純度。在Tris－甘氨酸電泳緩沖溶液（Tris 1．51g、Gly 9．4g、SDS 0．5g，加去離子水定容至500mL）體系中，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過Alphalmager 2200型凝膠成像系統(tǒng)分析凝膠圖像，比對標(biāo)準(zhǔn)蛋白計(jì)算純酶相對分子質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

2．1 β－葡萄糖苷酶的純化

2．1．1 硫酸銨粗提結(jié)果

通過對硫酸銨飽和度的篩選，確定在飽和度為30%～50%的硫酸銨作用下，β－葡萄糖苷酶鹽析量最大，經(jīng)鹽析除去了大量雜蛋白。

2．1．2 DEAE－Sephadex A－25柱層析結(jié)果（圖1）

由圖1可知，在280nm處有明顯光吸收的蛋白峰共4個(gè)，β－葡萄糖苷酶主要集中在峰Ⅰ（2?！?＃收集管）和峰Ⅲ（20＃～22＃收集管）。通過 DEAE－Sephadex A－25純化后，去除了大量雜蛋白，β－葡萄糖苷酶純度得到很大程度提高，從1．6倍提高到7．2倍。

2．1．3 Sephadex G－100柱層析結(jié)果（圖2）

由圖2可知，僅3＃收集管有明顯β－葡萄糖苷酶活性，其濃縮后即為純化酶液A。SDS－PAGE分析表明，純化酶液A中β－葡萄糖苷酶（酶A）的分子量為120kDa。與Ramani等［12］從繩狀青霉NCL1中分離得到的β－葡萄糖苷酶的分子量（120kDa）相同。

2．1．4 Sephadex G－50柱層析結(jié)果（圖3）

圖3 Sephadex G－50柱層析Fig．3 Chromatogram ofβ－glucosidase purified by Sephadex G－50

由圖3可知，在280nm處有明顯光吸收的蛋白峰有3個(gè)；蛋白質(zhì)峰Ⅱ（11＃收集管）的比酶活力最高，達(dá)到19．5IU·mg－1，其濃縮后即為純化酶液B。SDSPAGE分析表明，純化酶液B中β－葡萄糖苷酶（酶B）的分子量為19kDa。

2．1．5 β－葡萄糖苷酶的分離純化結(jié)果（表1）

表1 β－葡萄糖苷酶的分離純化結(jié)果Tab．1 Results of isolation and purification ofβ－glucosidase

由表1可知，粗酶液依次經(jīng)硫酸銨沉淀、DEAESephadex A－25柱層析、Sephadex G－50柱層析后，β－葡萄糖苷酶純度提高到8．1倍。

2．2 β－葡萄糖苷酶B的酶學(xué)性質(zhì)

2．2．1 最適反應(yīng)溫度

考察反應(yīng)溫度對β－葡萄糖苷酶B活性的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 反應(yīng)溫度對β－葡萄糖苷酶B活性的影響Fig．4 Effect of reaction temperature on β－glucosidase B activity

由圖4可知，β－葡萄糖苷酶B在40～60℃范圍具有較高活性，60℃時(shí)相對酶活最高；60～70℃之間的熱穩(wěn)定性良好，70℃時(shí)仍能保有63．5%的相對酶活；但70℃以上相對酶活迅速降低。表明β－葡萄糖苷酶B的最適反應(yīng)溫度為60℃。

2．2．2 最適反應(yīng)pH 值

在60℃下，考察反應(yīng)pH值對β－葡萄糖苷酶B活性的影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，β－葡萄糖苷酶B在pH值3．5～5．5范圍具有較高活性，pH值為4．5時(shí)相對酶活最高；當(dāng)pH值超過5．5后，隨著pH值的增大相對酶活快速下降。因此初步確認(rèn)β－葡萄糖苷酶B為酸性酶，其最適反應(yīng)pH值為4．5。

2．3 討論

圖5 反應(yīng)pH值對β－葡萄糖苷酶B活性的影響Fig．5 Effect of pH value onβ－glucosidase B activity

目前，對于繩狀青霉β－葡萄糖苷酶組分分離純化的研究相對較少，僅Ramani等報(bào)道繩狀青霉NCL1能夠產(chǎn)生120kDa的β－葡萄糖苷酶。本研究從繩狀青霉P07M12的發(fā)酵液中分離得到與Ramani分子量同為120kDa的β－葡萄糖苷酶（酶A），并首次分離純化出分子量為19kDa的β－葡萄糖苷酶（酶B），通過對其酶學(xué)特性的研究，確定其最適反應(yīng)溫度為60℃、最適反應(yīng)pH值為4．5。

近年來，人們認(rèn)識到繩狀青霉較木霉具有分泌較高水平β－葡萄糖苷酶、降解木質(zhì)纖維的各酶系組分之間能高效協(xié)同作用的特點(diǎn)，在木質(zhì)纖維素降解領(lǐng)域具有很大的優(yōu)勢與潛力。本研究首次從繩狀青霉的纖維素降解酶系中分離得到一種小分子量β－葡萄糖苷酶，對進(jìn)一步研究繩狀青霉纖維素水解酶系的代謝調(diào)控與降解木質(zhì)纖維素的作用機(jī)理具有重要意義。

3 結(jié)論

繩狀青霉（Penicillium funiculosum）粗酶液經(jīng)硫酸 銨 沉 淀、DEAE－Sephadex A－25 離 子 交 換 層 析、Sephadex G－50凝膠過濾層析等步驟，獲得了一種凝膠電泳均一的未知的β－葡萄糖苷酶，經(jīng)SDS－PAGE測得其分子量為19kDa，其最適反應(yīng)溫度為60℃、最適反應(yīng)pH值為4．5。

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