郭 紅，徐殿勝，王慶誠

（1．華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海200237；2．上海南方模式生物研究中心，上海201210）

核糖核酸酶是一類廣泛存在于動植物體內(nèi)的、具有水解作用的一類酶。它通過剪切轉(zhuǎn)錄核糖核酸及對核糖核酸進(jìn)行修飾和降解來達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長的目的［1］。

Onconase（豹蛙酶）是一種從北極豹蛙卵母細(xì)胞和早期胚胎中提取的核糖核酸酶，對人肺腺癌細(xì)胞、慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞及人體肺腺癌上皮細(xì)胞等都有細(xì)胞毒性作用［2，3］，是一種具有很大開發(fā)潛力的蛋白質(zhì)。

目前，國內(nèi)多通過畢赤酵母和大腸桿菌發(fā)酵來制備Onconase。作者在此先提純大腸桿菌發(fā)酵獲得的包涵體，再使包涵體復(fù)性得到有活力的Onconase蛋白。由于氧化型谷胱甘肽（GSSG）對蛋白質(zhì)中二硫鍵的重新形成起到很重要的作用，尿素對蛋白質(zhì)的復(fù)性也有意想不到的效果，因此，在復(fù)性緩沖溶液［4］中加入一定量的GSSG和尿素，并考察了復(fù)性溫度、尿素濃度、GSSG加入時間對復(fù)性效果的影響，以確定最優(yōu)稀釋復(fù)性條件，并與傳統(tǒng)的醋酸沉淀復(fù)性法進(jìn)行了對比。擬為Onconase生產(chǎn)工業(yè)化、提高Onconase產(chǎn)量提供幫助。

1 實驗

1．1 試劑與儀器

牛血清白蛋白（BSA）、二硫蘇糖醇（DTT）、尿素（Genebase）、RNase A、Tween－20、鹽酸胍（BIO BASIC INC），Triton X－100、GSSG（Amresco）等。

TES 緩 沖 溶 液：50mmol·L－1Tris－HCl，20 mmol·L－1EDTA，100mmol·L－1NaCl，pH 值8．0。

DIBB緩沖溶液：20mmol·L－1Tris－HCl，6mol·L－1Guanidine－HCl，65mmol·L－1DTT（現(xiàn)加），10 mmol·L－1EDTA，pH 值8．0。

RB緩沖溶液：100mmol·L－1Tris－AcOH，100 mmol·L－1NaCl，3．0mmol·L－1還原型谷胱甘肽，0．6mmol·L－1氧化型谷胱甘肽，pH值8．0。

DB緩沖溶液：20mmol·L－1乙酸。

多功能酶標(biāo)儀（BIOTEK），AKTA Purifier（GE）。

1．2 方法

1．2．1 菌體破碎及包涵體的洗滌

在內(nèi)含Onconase包涵體的大腸桿菌發(fā)酵液中加入溶菌酶，勻漿破碎，于6000r·min－1離心1h；加入TES緩沖溶液及25%Triton X－100，勻漿后再于6000 r·min－1離心1h，重復(fù)操作1次；再加入TES緩沖溶液，勻漿，于6000r·min－1離心1h，重復(fù)操作直至上清液澄清，得到包涵體。

1．2．2 包涵體蛋白的溶解和稀釋復(fù)性

將包涵體溶解于一定體積的DIBB緩沖溶液中，室溫振蕩過夜。測定蛋白含量后，用DIBB緩沖溶液將蛋白質(zhì)濃度稀釋到10mg·mL－1。

將包涵體裂解液緩慢滴加至配制好的包涵體復(fù)性緩沖溶液中，設(shè)定合適的轉(zhuǎn)速進(jìn)行攪拌，保證蛋白質(zhì)的終濃度為0．1mg·mL－1，置于4℃層析柜中復(fù)性72h。然后于6000r·min－1離心1h，去除因聚集產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀。

1．2．3 傳統(tǒng)的醋酸沉淀復(fù)性

將1mL包涵體溶液迅速用50mL DB稀釋，于4℃、12 000r·min－1離心30min，去沉淀，透析，去除變性劑。向溶液中加入20BV RB，并調(diào)節(jié)pH值為8．0，于4℃、12 000r·min－1離心30min，去沉淀。在復(fù)性緩沖溶液RB中4℃復(fù)性36～48h，于4℃、12 000r·min－1離心20min，去除復(fù)性過程產(chǎn)生的蛋白沉淀。

1．3 測定方法

1．3．1 蛋白含量的測定

采用Brandford法測定蛋白含量。

1．3．2 蛋白相對活力的測定

由于目的蛋白是核糖核酸酶，所以采用RNA熒光底物法測定目的蛋白活力，即目的蛋白Onconase和帶有熒光標(biāo)記的底物RNA進(jìn)行反應(yīng)，通過檢測吸光度值得到蛋白相對活力（由于不需要各組實驗間的對比，為簡化實驗，直接利用每個時刻得到的活力曲線的斜率作為縱坐標(biāo)，比較各組條件下得到的蛋白相對活力）。

2 結(jié)果與討論

2．1 醋酸沉淀法的復(fù)性效果（圖1）

圖1 醋酸沉淀法的復(fù)性效果Fig．1 The renaturation efficiency of acetic acid sinking method

由于醋酸沉淀法無需加入輔助復(fù)性的物質(zhì)，節(jié)省了工藝成本，所以不失為一種可供選擇的方法。

2．2 稀釋復(fù)性條件的優(yōu)化

2．2．1 復(fù)性溫度的影響

復(fù)性緩沖溶液pH值為8．0、尿素濃度為2mol·L－1、GSSG先于包涵體加入復(fù)性緩沖溶液中、復(fù)性緩沖溶液體積為50mL、蛋白質(zhì)終濃度控制在0．1mg·mL－1，考察復(fù)性溫度對復(fù)性效果（復(fù)性緩沖溶液中總蛋白相對活力）的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 復(fù)性溫度對復(fù)性效果的影響Fig．2 The effect of renaturation temperature on renaturation efficiency

從圖2可知，4℃下復(fù)性緩沖溶液中總蛋白相對活力最高。蛋白活力應(yīng)該隨著溫度升高而增大，且到達(dá)某一臨界溫度后不會再繼續(xù)上升。但包涵體復(fù)性過程需要經(jīng)過中間狀態(tài)——熔球態(tài)，25℃時的復(fù)性效果沒有4℃好，這可能是因為25℃時包涵體進(jìn)入熔球態(tài)的速度較快，容易出現(xiàn)錯誤折疊的情況，進(jìn)而影響到總蛋白的相對活力。

2．2．2 尿素濃度的影響

復(fù)性緩沖溶液pH值為8．0、復(fù)性溫度為4℃、復(fù)性緩沖溶液體積為50mL、蛋白質(zhì)終濃度控制在0．1 mg·mL－1，考察尿素濃度對復(fù)性效果的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 尿素濃度對復(fù)性效果的影響Fig．3 The effect of urea concentration on renaturation efficiency

從圖3可知，尿素濃度為2mol·L－1時，復(fù)性緩沖溶液中的總蛋白相對活力最高，這可能是因為，濃度小于2mol·L－1時，尿素的主要作用是屏蔽蛋白質(zhì)所帶電荷，防止蛋白質(zhì)聚集沉淀的損失；而濃度大于2 mol·L－1時，尿素奪取蛋白質(zhì)氫鍵的作用要強(qiáng)于屏蔽蛋白質(zhì)電荷的作用，從而促進(jìn)了蛋白質(zhì)變性的發(fā)生。

2．2．3 GSSG加入時間的影響

復(fù)性緩沖溶液pH值為8．0、復(fù)性溫度為4℃、復(fù)性緩沖溶液體積為50mL、蛋白質(zhì)終濃度控制在0．1 mg·mL－1、復(fù)性緩沖溶液中尿素濃度分別為2mol·L－1和1．5mol·L－1，考察 GSSG加入時間對復(fù)性效果的影響，結(jié)果見圖4。

從圖4可知，當(dāng)尿素濃度為2mol·L－1時，GSSG先于包涵體加入復(fù)性緩沖溶液中效果稍好，但差別不明顯；當(dāng)尿素濃度為1．5mol·L－1時，GSSG后于包涵體加入復(fù)性緩沖溶液中效果較好。

2．3 不同復(fù)性體系比較

基于以上實驗結(jié)果，分別取350mL3種緩沖溶液：加有GSSG的含2mol·L－1尿素的稀釋復(fù)性緩沖溶液、含1．5mol·L－1尿素的稀釋復(fù)性緩沖溶液、醋酸沉淀復(fù)性緩沖溶液，采用稀釋復(fù)性方法［5］，緩慢滴加包涵體裂解液，攪拌（5min后，在含1．5mol·L－1尿素的稀釋復(fù)性緩沖溶液中加入等量的GSSG），放入4℃層析柜中復(fù)性72h。然后于6000r·min－1、4℃離心1h，去除沉淀，用陽離子交換柱South15s進(jìn)一步純化。測定Onconase含量，并計算回收率，結(jié)果見表1。

圖4 GSSG加入時間對復(fù)性效果的影響Fig．4 The effect of addition time of GSSG on renaturation efficiency

表1 復(fù)性并純化后的Onconase蛋白含量及回收率Tab．1 The content and recovery of Onconase after renaturation and purification

由表1可知，先加GSSG的含2mol·L－1尿素的稀釋復(fù)性緩沖溶液的復(fù)性效果最好，Onconase含量和回收率均高于其它兩種復(fù)性體系。

2．3 討論

（1）由于Onconase的等電點較高，為9．7左右，故選用陽離子交換柱層析進(jìn)行純化。

（2）常用的蛋白質(zhì)變性劑為6mol·L－1尿素或4 mol·L－1鹽酸胍。這是由于高濃度的尿素或鹽酸胍可以破壞蛋白質(zhì)的氫鍵，即蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，從而使蛋白質(zhì)不能形成活性所必需的高級結(jié)構(gòu)，起到變性作用。然而近年來研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的尿素具有降低非正確折疊和蛋白的活性狀態(tài)、提高解折疊狀態(tài)和折疊中間體的穩(wěn)定性的作用［6，7］。這可能是因為尿素的溶解作用一方面會奪取蛋白質(zhì)的氫鍵，另一方面卻可以防止蛋白質(zhì)的聚集（可能是由于尿素屏蔽了蛋白質(zhì)之間的電荷作用）。為此，本研究選擇尿素作為變性劑，并考察了尿素濃度對復(fù)性效果的影響。

（3）研究發(fā)現(xiàn)，待復(fù)性的蛋白質(zhì)本身含有二硫鍵時，應(yīng)該在復(fù)性過程中加入諸如GSH（還原型谷胱甘肽）／GSSG、DTT／GSSG等具有氧化還原作用的體系。氧化還原體系通過促進(jìn)不正確形成的二硫鍵快速交換反應(yīng)，提高了正確配對的二硫鍵的產(chǎn)率。Onconase本身只有104個氨基酸，卻含有4個二硫鍵，其二硫鍵能否正確折疊對蛋白活力影響很大。因此，實驗選擇DTT／GSSG氧化還原體系，以確保Onconase的正確折疊。

以往的實驗中曾選擇在過夜裂解包涵體時加入DTT、在配制復(fù)性緩沖溶液時加入GSSG的方式，并取得了良好的效果。后有報道稱將GSSG后于包涵體加入到復(fù)性緩沖溶液中效果更好［6］?？紤]到在蛋白質(zhì)折疊過程中，從伸展態(tài)到中間態(tài)的速度只需要幾毫秒，因此將GSSG和包涵體加入到復(fù)性緩沖溶液中的時間間隔設(shè)為5min，對GSSG先于、后于包涵體加入到復(fù)性緩沖溶液中的效果進(jìn)行比較，但由于時間所限，并沒有進(jìn)行時間梯度上的探討。

然而，對于1．5mol·L－1尿素體系和2mol·L－1尿素體系所得出的結(jié)論為何相反的問題，由于因素復(fù)雜，有待進(jìn)一步深入探討。

（4）對蛋白HPLC級別的純度分析需要進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

采用稀釋復(fù)性方法從包涵體中復(fù)性得到有活力的Onconase蛋白，并與傳統(tǒng)的醋酸沉淀復(fù)性方法進(jìn)行了比較，考察了復(fù)性溫度、尿素濃度、GSSG加入時間對復(fù)性效果的影響。結(jié)果表明，在最佳復(fù)性溫度為4℃、采用最佳復(fù)性體系（先加GSSG的含2mol·L－1尿素的稀釋復(fù)性緩沖溶液）時，復(fù)性純化后Onconase含量和回收率明顯高于醋酸沉淀復(fù)性法。

［1］錢敏，李關(guān)榮，魯成．核糖核酸酶研究進(jìn)展［J］．蠶業(yè)科學(xué)，2004，30（2）：185－190．

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［6］Chen J，Liu Y D，Li X N，et al．Cooperative effects of urea and L－arginineon protein refolding［J］．Protein Expr Purifi，2009，66（1）：82－90．

［7］Matsubara M，Nohara D，Kurimoto E，et al．"Loose folding"and"delayed oxidation"procedures successfully applied for refolding of fully reduced hen egg white lysozyme［J］．Chemical ＆ Pharmaceutical Bulletin，1993，41（7）：1207－1210．