李 偉，余 艦，龍艷麗，趙 敏，張國(guó)棟

（1.湖北省咸寧市第一人民醫(yī)院病理科 437000；2.貴州省遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院法醫(yī)鑒定中心 563003；3.貴州省遵義醫(yī)學(xué)院法醫(yī)系 563003；4.廣西桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院 541000）

羊水栓塞（amniotic fluid embolism，AFE）是產(chǎn)科發(fā)生率低卻兇險(xiǎn)的并發(fā)癥之一，嚴(yán)重威脅母嬰安全［1］，且AFE的病死率并未隨著醫(yī)療的進(jìn)步而有所降低［2］。羊水及其有形成分進(jìn)入母體循環(huán)后如何導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)一系列病理生理變化，迄今為止依然不十分清楚。Benson等［3］認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制可能是無(wú)抗體參加的過敏樣反應(yīng)，羊水進(jìn)入母體后激發(fā)內(nèi)源性介質(zhì)的釋放，建議將AFE稱之為“妊娠過敏樣綜合征”，與此相關(guān)的介質(zhì)有補(bǔ)體C3a、類胰蛋白酶等［4］。本課題以28例尸檢病例為研究對(duì)象，采用免疫組織化學(xué)法來(lái)檢測(cè)補(bǔ)體C3a、類胰蛋白酶等在肺組織中的表達(dá)，從免疫介導(dǎo)的過敏角度初步研究與探討AFE可能的發(fā)病機(jī)制，試圖為AFE的診斷提供一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究的標(biāo)本均來(lái)自遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科及遵義醫(yī)院。選取近10年產(chǎn)科尸檢病例28例，臨床高度懷疑尸檢明確診斷為AFE病例4例（AFF組）；臨床診斷為產(chǎn)后出血而尸檢及蘇木素－伊紅（HE）染色未發(fā)現(xiàn)羊水有形成分的病例16例，包括HE染色高度可疑AFE病例（PHH組）；其他8例（陰性對(duì)照組）死因分別為：妊娠期高血壓疾病、麻醉意外、晚孕疤痕子宮破裂、妊娠期外傷等。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)試劑 補(bǔ)體C3a（北京博奧森公司），TPS（美國(guó)DAKO公司），熒光顯色劑，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑，磷酸鹽緩沖液（PBS），山羊血清封閉液（北京中衫金橋公司）。

1.2.2 方法及結(jié)果判定 所有標(biāo)本均以10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。連續(xù)石蠟切片，厚約4μm。取肺組織切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，免疫組織化學(xué)標(biāo)記及熒光標(biāo)記。標(biāo)記抗原為補(bǔ)體C3a、TPS。免疫組織化學(xué)采用Envision法，DAB顯色。組織抗原修復(fù)采用高壓與微波修復(fù)處理。補(bǔ)體C3a稀釋濃度為1∶50，TPS稀釋濃度為1∶100。結(jié)果判定以肺小動(dòng)脈或者肺毛細(xì)血管內(nèi)或血管周圍出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性結(jié)果。棕黃色顆粒少或顏色淡為弱陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所得數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，運(yùn)用四表格法的確切概率（FISH法）計(jì)算，以P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

尸檢明確診斷為AFE的4例病例（AFE組），其HE染色的肺組織切片中，小血管以及毛細(xì)血管內(nèi)看到成團(tuán)或絲狀的鱗狀上皮（圖1）。

AFE組TPS陽(yáng)性表達(dá)4例，陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色顆粒呈光環(huán)圍繞肥大細(xì)胞周圍，見圖2，陰性對(duì)照組肺組織和AFE組中補(bǔ)體C3a表達(dá)情況見圖3、4，TPS熒光陽(yáng)性表達(dá)則在肺組織毛細(xì)血管內(nèi)可見綠色熒光斑，見圖5；PHH組TPS陽(yáng)性表達(dá)9例；陰性對(duì)照組TPS弱陽(yáng)性表達(dá)1例；AFE組、PHH組與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 AFE病例肺小動(dòng)脈內(nèi)羊水有形成分（HE×40）

圖2 肺組織中肥大細(xì)胞脫顆粒TPS表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)×400）

圖3 陰性對(duì)照組肺組織中補(bǔ)體C3a表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)×100）

圖4 AFE組補(bǔ)體C3a情況（免疫組織化學(xué)×100）

AFE組補(bǔ)體C3a表達(dá)較對(duì)照組均降低，陰性對(duì)照組中補(bǔ)體C3a表達(dá)情況，可見多量棕黃色顆粒，呈陽(yáng)性表達(dá)（圖3）；圖4AFE組中補(bǔ)體C3a情況，與圖3比較棕黃色顆粒明顯減少，呈弱陽(yáng)性表達(dá)；PHH組部分補(bǔ)體C3a表達(dá)較對(duì)照組亦降低，弱陽(yáng)性表達(dá)7例；陰性對(duì)照組補(bǔ)體C3a8例均陽(yáng)性表達(dá)；AFE組、PHH組與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖5 肺泡壁毛細(xì)血管TPS熒光表達(dá)（免疫熒光×200）

3 討 論

AFE雖發(fā)生率低但母嬰死亡率高，易引起醫(yī)療糾紛需要法醫(yī)學(xué)鑒定［5］。目前尚無(wú)統(tǒng)一、明確的診斷標(biāo)準(zhǔn)，因此不少患者可能被誤診，一些輕癥及不典型患者會(huì)因一過性表現(xiàn)而漏診，貽誤最佳治療時(shí)機(jī)。

傳統(tǒng)診斷無(wú)法解釋補(bǔ)體活化及類胰蛋白酶釋放現(xiàn)象［6］，近年研究發(fā)現(xiàn)AFE在血流動(dòng)力學(xué)及血液學(xué)上與過敏性休克極為相似［7］。多數(shù)學(xué)者在研究AFE病例時(shí)，僅僅評(píng)估其類胰蛋白酶水平，從肥大細(xì)胞脫顆粒角度探討其與過敏反應(yīng)的關(guān)系，并沒有同時(shí)檢測(cè)補(bǔ)體水平變化［8］。值得一提的是，在補(bǔ)體參與經(jīng)典的抗原抗體介導(dǎo)的過敏反應(yīng)中，可引起肥大細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)［9］。補(bǔ)體活化可直接、間接導(dǎo)致機(jī)體自身組織損傷，可能是肺循環(huán)功能障礙的主要原因，故補(bǔ)體活化可能是AFE的始動(dòng)環(huán)節(jié)［8］。本研究中AFE組補(bǔ)體C3a表達(dá)與陰性對(duì)照組比較，大幅度的降低，而陰性對(duì)照組的病例之間的補(bǔ)體水平表達(dá)沒有明顯改變，說(shuō)明了在AFE過程中可能存在補(bǔ)體活化；產(chǎn)后出血病例中，7例補(bǔ)體C3a表達(dá)呈弱陽(yáng)性，說(shuō)明此部分的產(chǎn)后出血病例中，可能也存在補(bǔ)體活化。目前關(guān)于補(bǔ)體在AFE中作用機(jī)制的研究尚少，本課題的回顧性研究對(duì)補(bǔ)體C3a與AFE的關(guān)系不能做最終定論。其在AFE中的確切分子生物學(xué)機(jī)制仍待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，AFE病例HE染色均能觀察到羊水有形成分，在支氣管壁、肺泡毛細(xì)血管檢測(cè)到類胰蛋白酶，呈衛(wèi)星現(xiàn)象包繞肥大細(xì)胞，免疫熒光陽(yáng)性［10］，表明肥大細(xì)胞發(fā)生脫顆粒反應(yīng)，提示在AFE的過程中可能存在過敏反應(yīng)。本研究16例產(chǎn)后出血（包括2例疑似AFE），類胰蛋白酶陽(yáng)性表達(dá)9例，表明此部分產(chǎn)后出血也可能存在過敏反應(yīng)。國(guó)外報(bào)道，超過50%的AFE尸檢病例，并無(wú)AFE典型臨床表現(xiàn)［11］，僅為大量產(chǎn)后出血［12］。本研究中的9例產(chǎn)后出血是否與AFE有直接關(guān)系，尚不能確定，還有待更進(jìn)一步的研究。

對(duì)AFE患者或是可疑AFE患者可嘗試同時(shí)檢測(cè)補(bǔ)體C3a、類胰蛋白酶的含量，為臨床早期治療、預(yù)防嚴(yán)重并發(fā)癥、緩解緊張的醫(yī)患關(guān)系及為法醫(yī)學(xué)鑒定診斷提供一個(gè)較準(zhǔn)確的依據(jù)，也為AFE的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

［1］孫富琴.羊水栓塞診治進(jìn)展［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，17（26）：4201－4203.

［2］Abenhaim HA，Azoulay L，Kramer MS，et al.Incidence and risk factors of amniotic fluid embolisms：apopulationbased study on 3million births in the United States［J］.Am J Obstet Gynecol，2008，199（1）：e1－8.

［3］Benson MD.A hypothesis regarding complement activation and amniotic fluid embolism［J］.Med Hypotheses，2007，68（5）：1019－1025.

［4］Liao WC，Jaw FS.A noninvasive evaluation analysis of amniotic fluid embolism and disseminated intravascular coagulopathy［J］.J Matern Fetal Neonatal Med，2011，24（11）：1411－1415.

［5］Stolk KH，Zwart JJ，Schutte J，et al.Severe maternal morbidity and mortality from amniotic fluid embolism in the Netherlands［J］.Acta Obstet Gynecol Scand，2012，91（8）：991－995.

［6］侯志剛，宋子亨，趙敏，等.羊水栓塞孕鼠血清類胰蛋白酶的變化及意義［J］.遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，34（4）：407－408，412.

［7］Clark SL.Amniotic fluid embolism［J］.Clin Obstet Gynecol，2010，53（14）：322－328.

［8］Fineschi V，Riezzo I，Cantatore S，et al.Complement C3a expression and tryptase degranulation as promising histopathological tests for diagnosing fatal amniotic fluid embolism［J］.Virchows Arch，2009，454（3）：283－290.

［9］Bénard M，Raoult E，Vaudry D，et al.Role of complement anaphylatoxin receptors（C3aR，C5aR）in the development of the rat cerebellum［J］.Mol Immunol，2008，45（14）：3767－3774.

［10］Sinicina I，Pankratz H，Bise K，et al.Forensic aspects of post－mortem histological detection of amniotic fluid embolism ［J］.Int J Legal Med，2010，124（1）：55－62.

［11］Stafford I，Sheffield J.Amniotic fluid embolism［J］.Obstet Gynecol Clin N Am，2007，34：545－553.

［12］趙敏，余艦，張國(guó)棟.產(chǎn)后出血與羊水栓塞關(guān)系的初步研究［J］.中國(guó)婦幼保健，2011，26（3）：356－357.