張 濤，何平平，周 俊，羅志剛，歐陽新平

（南華大學(xué)：1.附屬第二醫(yī)院泌尿外科；2.護理學(xué)院；3.附屬第二醫(yī)院檢驗科；4.醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，湖南衡陽 421001）

Y－盒結(jié)合蛋白1（Y－box binding protein－1，YB－1）是 Y 盒蛋白家族的成員之一，廣泛分布于原核和真核生物細(xì)胞中，參與了多種生物學(xué)過程［1－2］。研究表明YB－1與人類惡性腫瘤的關(guān)系密切，在多種惡性腫瘤中YB－1表達(dá)上調(diào)，特別在前列腺癌和乳腺癌中［3－5］。YB－1的表達(dá)水平隨腫瘤的惡性程度和病情的惡化而增加［5］。然而YB－1是否影響前列腺癌的遷移與侵襲目前還不清楚。因此本文構(gòu)建了針對YB－1的siRNA重組質(zhì)粒，觀察RNA干擾沉默YB－1表達(dá)對前列腺癌株P(guān)C－3細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 前列腺癌PC－3細(xì)胞株（北京協(xié)和細(xì)胞資源中心）；質(zhì)粒pGenesil－1（武漢晶賽）。YB－1特異性DNA片段（上海英駿）。脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000、Trizol、RNase抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶SSRT、Taq酶、HindⅢ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶（Invitrogen）。兔抗人 GAPDH和 YB－1單克隆抗體以及二抗（Santa Cruz），引物（上海生工）。

1.2 方法

1.2.1 YB－1siRNA序列設(shè)計和重組質(zhì)粒的鑒定 根據(jù)Gen－Bank中的YB－1基因序列，在線分析設(shè)計，確定2個靶序列，設(shè)計2個針對 YB－1的短發(fā)夾 RNA（small hair RNA，shRNA）。序列1：正義鏈5′－GAT CCG GAA GAT GTA TTT GTA CAC TTC AAG AGA GTG TAC AAA TAC ATC TTC CTT TTT TA－3′；反 義 鏈 5′－AGC TTA AAA AAG GAA GAT GTA TTT GTA CAC TCT CTT GAA GTG TAC AAA TAC ATC TTC CG－3′。序列 2：正義鏈：5′－GAT CCG GTT CCC ACC TTA CTA CAT TTC AAG AGA ATG TAG TAA GGT GGG AAC CTT TTT TA－3′；反 義 鏈：5′－AGC TTA AAA AAG GTT CCC ACC TTA CTA CAT TCT CTT GAA ATG TAG TAA GGT GGG AAC CG－3′。將合成的DNA正義鏈和反義鏈與pGenesil－1質(zhì)粒連接。轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH－5α菌種，篩選陽性克隆，搖菌抽提質(zhì)粒。重組質(zhì)粒和空載體進行HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切，片段大小預(yù)期分別為400和350bp。產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。2個重組質(zhì)粒命名為pGenesil－1－YB－1－1（質(zhì)粒1）和pGenesil－1－YB－1－2（質(zhì)粒2）。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和實驗分組 PC－3細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。實驗分為4個組：未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的PC－3細(xì)胞為空白對照組，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒為質(zhì)粒對照組，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒1為pGenesil－1－YB－1－1組和轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒2為pGenesil－1－YB－1－2組。

1.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC－3細(xì)胞 提取重組質(zhì)粒，測定濃度。將細(xì)胞按2×105／孔轉(zhuǎn)種于6孔培養(yǎng)板，細(xì)胞融合度至60%～80%時，用無血清培養(yǎng)基稀釋shRNA雙鏈體，將shRNA和LipofectamineTM 2000按1∶2混合，室溫下孵育20min，加入6孔板中，混勻，37℃、5%CO2培養(yǎng)6h后終止轉(zhuǎn)染。

1.2.4 RT－PCR 提取細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄后PCR擴增。PCR條件：95℃ 變性4min，94℃30s，60℃30s，72℃35s，循環(huán)45次，72℃ 延伸5min。YB－1PCR正向引物：5′－ACA AGA AGG TCA TCG CAA CG－3′，反向引物：5′－TAA TGG TTA CGG TCT GCT GC－3′，產(chǎn)物長度283bp。GAPDH為內(nèi)參。瓊脂糖凝膠電泳后凝膠圖像分析系統(tǒng)進行分析。YB－1 mRNA表達(dá)抑制率計算：抑制率（%）＝［1－（RNA干擾組條帶灰度／RNA干擾組GAPDH條帶灰度）／（對照組條帶灰度／對照組GAPDH條帶灰度）］×100%。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）法 提取細(xì)胞總蛋白，BAC法定量蛋白。100μL蛋白樣品加入到2×十二烷基硫鈉（SDS）凝膠緩沖液中，煮沸。6%SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）2h分離蛋白。分離的蛋白用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至聚偏二氧乙烯（PVDF）膜上。10%脫脂牛奶封閉2h，加入兔抗人 YB－1（1：200）和 GAPDH（1：300）抗體，4℃下過夜。加入二抗，4℃下孵育4h。顯影后進行半定量分析并計算蛋白表達(dá)抑制率。

1.2.6 3－（4，5－二甲基噻唑）－2，5－二苯基四氮唑溴鹽（MTT）將PC－3細(xì)胞以1×104／孔接種于96孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)24、48、72和96h。處理結(jié)束后每孔加入5mg／mL的MTT溶液20μL，培養(yǎng)4h。吸去上清液，每孔加入200μL DMSO，孵育10min，用酶標(biāo)儀在490nm處測定吸光度A值。

1.2.7 劃痕實驗 將PC－3細(xì)胞1×105／L接種于6孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)24h。細(xì)胞在孔板的底面形成單細(xì)胞層。在單層細(xì)胞表面用100μL移液器槍頭垂直劃痕，PBS輕洗2次，除去細(xì)胞碎片，繼續(xù)培養(yǎng)24h，在倒置顯微鏡下觀察劃痕處細(xì)胞的遷移情況，并拍照。

1.2.8 Transwell實驗 將PC－3細(xì)胞的密度調(diào)至5×105／mL，取200μL加入上室，下室內(nèi)加入600μL含100 ng／mL基質(zhì)細(xì)胞衍生因子－1的培養(yǎng)液。37℃、5%CO2培養(yǎng)48h，取出上室，遷移并黏附到下室面的細(xì)胞用甲醇固定，蘇木素－伊紅（HE）染色觀察。每個小室在高倍鏡（×200）下隨機取6個視野計數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以表示，組間比較用單因素方差分析；兩兩比較采用SNK－q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 重組質(zhì)粒經(jīng)Hind III和EcoRⅠ雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳分析可見1條約400bp的條帶。見圖1。

2.2 RNA干擾對PC－3細(xì)胞中YB－1mRNA和蛋白表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染48h后，與質(zhì)粒對照組相比，pGenesil－1－YB－1－1組和pGenesil－1－YB－1－2組轉(zhuǎn)染的PC－3細(xì)胞的 YB－1mRNA和蛋白水平均顯著性降低（P＜0.05）。pGenesil－1－YB－1－1組和pGenesil－1－YB－1－2組 mRNA表達(dá)抑制率分別達(dá)36.23% 和39.42%，蛋白表達(dá)抑制率分別達(dá)41.56%和55.33%。質(zhì)粒對照組與空白對照組相比YB－1mRNA和蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、3。

圖1 重組質(zhì)粒酶切鑒定

圖2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48hPC－3細(xì)胞中YB－1mRNA表達(dá)

圖3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48hPC－3細(xì)胞中YB－1蛋白表達(dá)

2.3 RNAi沉默YB－1對PC－3細(xì)胞增殖的影響 轉(zhuǎn)染48h后，與質(zhì)粒對照組相比，pGenesil－1－YB－1－1組和pGenesil－1－YB－1－2組轉(zhuǎn)染的PC－3細(xì)胞的增殖能力明顯降低（P＜0.05）。而質(zhì)粒對照組與空白對照組相比細(xì)胞的增殖能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 4組細(xì)胞不同時間A值（）

表1 4組細(xì)胞不同時間A值（）

組別0.24±0.040.35±0.050.48±0.060.64±0.08質(zhì)粒對照組 0.25±0.030.33±0.050.51±0.070.62±0.07 pGenesil－1－YB－1－1組 0.18±0.020.24±0.030.31±0.050.41±0.07 pGenesil－1－YB－1－2組24h 48h 72h 96h空白對照組0.17±0.020.22±0.010.27±0.040.35±0.06

2.4 RNAi沉默YB－1對PC－3細(xì)胞遷移力的影響 轉(zhuǎn)染48h后，與質(zhì)粒對照組比較，pGenesil－1－YB－1－1組和pGenesil－1－YB－1－2組細(xì)胞的運動速度均明顯減慢，pGenesil－1－YB－1－1組和pGenesil－1－YB－1－2組細(xì)胞劃痕已經(jīng)基本長滿，而空白對照組和質(zhì)粒對照組細(xì)胞劃痕依然明顯。見圖4。

Transwell結(jié)果顯示：與質(zhì)粒對照組比較，pGenesil－1－YB－1－1組和pGenesil－1－YB－1－2組穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）?？瞻讓φ战M、質(zhì)粒對照組、pGenesil－1－YB－1－1組和pGenesil－1－YB－1－2組穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)分別為（123.71±13.25）、（135.73±14.18）、（67.73±8.82）和（51.73±6.75）個。

圖4 RNAi沉默YB－1基因表達(dá)對前列腺癌細(xì)胞遷移運動能力的影響

3 討 論

前列腺癌是中老年男性常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤。惡性腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲作用是腫瘤轉(zhuǎn)移的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，是前列腺癌治療的重要措施。siRNA已經(jīng)成為研究基因功能、病毒和腫瘤等的重要手段［6］。RNAi是由雙鏈RNA使靶mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默［7］。

YB－1是最早發(fā)現(xiàn)的Y－盒結(jié)合蛋白家族成員，廣泛存在于從細(xì)菌到人類的許多物種中，特異性結(jié)合靶基因啟動子和增強子內(nèi)部的Y－盒序列而調(diào)控靶基因的表達(dá)，參與了細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、mRNA選擇性剪接、翻譯調(diào)控、DAN修復(fù)、細(xì)胞再生和增殖等過程［8－9］。YB－1在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、腫瘤治療及預(yù)后中都發(fā)揮著重要作用［10］。YB－1在前列腺癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤中高表達(dá)，YB－1表達(dá)水平高提示預(yù)后不良，被認(rèn)為是腫瘤診斷的一種新型標(biāo)志物［11］。siRNA可沉默人乳腺癌細(xì)胞中YB－1基因表達(dá)，并降低了細(xì)胞侵襲和成球能力［12］。這表明siRNA沉默YB－1基因能成為腫瘤治療的新策略。

在本實驗中設(shè)計并構(gòu)建了2條針YB－1基因siRNA序列，分別轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C－3細(xì)胞，RT－PCR和 Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)兩條siRNA都能夠有效的抑制YB－1基因的表達(dá)。2條YB－1siRNA序列均顯著抑制細(xì)胞增殖。這些結(jié)果表明YB－1siRNA序列可有效地抑制PC－3細(xì)胞中YB－1基因的表達(dá)和細(xì)胞增殖，但pGenesil－1－YB－1－2序列抑制效果更佳。這可能是由于不同細(xì)胞其靶RNA的空間構(gòu)象、位點以及許多其他因素的影響所致。本研究結(jié)果表明2條YB－1siRNA序列均抑制PC－3細(xì)胞的體外侵襲力。這些結(jié)果表明YB－1基因可作為前列腺癌基因治療的靶點，為siRNA介導(dǎo)的前列腺癌基因沉默治療提供實驗依據(jù)，但其詳細(xì)的機制還有待于進一步研究。

總之，本研究表明siRNA沉默YB－1表達(dá)可以抑制前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移能力。

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