李國(guó)術(shù)，何平平，王 波，周壽紅，歐陽(yáng)新平△

（1.衡陽(yáng)市中心醫(yī)院急診科，湖南衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)心血管疾病研究所／生理學(xué)教研室，湖南衡陽(yáng) 421001；3.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，湖南衡陽(yáng) 421001）

泡沫細(xì)胞的形成是動(dòng)脈粥樣硬化（artherosclerosis，AS）重要的病理學(xué)基礎(chǔ)，單核巨噬細(xì)胞吞噬修飾的低密度脂蛋白，特別是氧化修飾低密度脂蛋白（oxidized low－density lipoprotein，ox－LDL）而形成泡沫細(xì)胞［1］。肝外組織細(xì)胞中的膽固醇通過(guò)血液運(yùn)輸?shù)礁闻K，合成膽汁排出體外，稱為逆向膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)（reverse cholesterol transport，RCT）。RCT能力的減弱是泡沫細(xì)胞形成的重要原因。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ATP－binding cassette transporter A1，ABCA1）被稱作RCT的“看門人”，發(fā)揮抗 AS作用［2］。硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）被稱為第3種氣體信號(hào)分子，廣泛分布于各系統(tǒng)中［3－4］。H2S能延緩AS的進(jìn)程，縮小AS斑塊，具有抗AS作用［5］。本研究旨在觀察H2S對(duì)泡沫細(xì)胞膽固醇流出和ABCA1表達(dá)的影響，探討H2S抗AS的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 RAW264.7細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中。細(xì)胞融合60%～70%時(shí)，ox－LDL（50μg／mL）孵育48h，轉(zhuǎn)變成泡沫細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為泡沫細(xì)胞組、硫氫化鈉（sodium hydrosulfide，NaHS）（10－5、10－4和10－3mol／L）處理0、12、24和48h組。

1.2 方法

1.2.1 試劑及儀器 NaHS購(gòu)自Sigma公司。［3H］標(biāo)記的膽固醇（原子能院同位素所）。ABCA1兔抗鼠一抗以及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗購(gòu)自Santa Cruz公司。MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒、總RNA提取試劑盒和Hot Star Taq Master Mix試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2.2 膽固醇流出檢測(cè) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞，濃度為3.0×106個(gè)／mL，接種6孔板，含10%胎牛血清、0.2μCi／L［3H］標(biāo)記的膽固醇和ox－LDL（50μg／mL）的培養(yǎng)液共敷育48h。H2S組用 NaHS（10－5、10－4和10－3mol／L）繼續(xù)敷育12、24和48h。更換培養(yǎng)液，細(xì)胞在無(wú)血清含50μg／mL載脂蛋白AI的新鮮培養(yǎng)液中敷育12h，液閃儀檢測(cè)培養(yǎng)液和細(xì)胞中的［3H］膽固醇濃度。膽固醇流出率用培養(yǎng)液中［3H］／總值［3H］（培養(yǎng)液＋細(xì)胞）×100%表示。

表1 H2S對(duì)泡沫細(xì)胞內(nèi)FC及CE濃度的影響（n＝5）

表2 H2S對(duì)泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出的影響（，n＝5）

表2 H2S對(duì)泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出的影響（，n＝5）

a：P＜0.05，與泡沫細(xì)胞組比較；b：P＜0.05，與 NaHS（10－5 mol／L）組比較。c：P＜0.05，與 NaHS（10－4 mol／L）組比較；d：P＜0.05，與 NaHS處理0h比較。e：P＜0.05，與NaHS處理12h比較；f：P＜0.05，與 NaHS處理24h比較。

膽固醇流出率（%）組別0h 12h 24h 48h泡沫細(xì)胞組 13.46±1.76 14.39±2.06 15.15±1.94 17.82±2.25 NaHS（10－5 mol／L）組 13.79±1.54 14.26±1.84 17.69±2.17 20.43±3.14 NaHS（10－4 mol／L）組 14.21±1.13 15.51±1.64 28.91±3.65abde 36.80±1.13abdef NaHS（10－3 mol／L）組 14.68±1.79 16.37±2.12 42.77±4.21abcde 54.17±5.71abcdef

1.2.3 高效液相色譜檢測(cè) 超聲破碎細(xì)胞，BCA法蛋白定量。細(xì)胞裂解產(chǎn)物分成兩份，一份測(cè)定游離膽固醇（free cholesterol，F(xiàn)C），加入等體積8.9mmol／L的KOH醇。另一份測(cè)定總膽固醇（total cholesterol，TC），加入等體積的15%KOH醇。兩份樣本加入6%三氯乙酸及等體積正己烷和異丙醇的混合溶液，1500r／min離心5min，收集上層有機(jī)相。加入100μL異丙醇、正庚烷和乙晴的混合溶液溶解樣品。1500r／min離心5min，收集上清液進(jìn)行高效液相色譜分析。采用C18柱，以異丙醇∶正庚烷∶乙晴為流動(dòng)相進(jìn)行非梯度洗脫，流速為1mL／min，216nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，以峰面積定量膽固醇。膽固醇酯（cholesterol ester，CE）經(jīng)膽固醇酯酶水解為膽固醇，測(cè)定TC量，TC量減去FC量為CE量，以mg／mg細(xì)胞蛋白為膽固醇和CE單位。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 收集細(xì)胞，Trizol提取細(xì)胞的總RNA。提取的總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA第一鏈。取cDNA樣品梯度稀釋，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)總體系為30μL，包含cDNA 4μL，上下游引物各1μL，dNTP Mix（2×）8μL。ABCA1引物：上游：5′－AGG AAA CCC AAT CCC AGA TAC CC－3′，下游：5′－GCT CGG AGG AAG TGC TTG AGA AT－3′。β－actin引物：上游：5′－CCA TCA TCT TGC AGG AGC G－3′，下游：5′－CTG GCA GTG AGC TAT ACT CG－3′。采用2－△△CT法處理數(shù)據(jù)。

1.2.5 Western blotting檢測(cè) 提取細(xì)胞總蛋白，BAC法蛋白定量。100μL樣本加入到2×SDS凝膠加樣緩沖液中煮沸。凝膠電泳1h分離蛋白質(zhì)，分離的蛋白轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙稀膜上。10%脫脂牛奶封閉2h，加入兔抗鼠ABCA1和β－actin一抗，4℃下過(guò)夜。加入羊抗兔二抗，孵育6h。顯影后進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用表示，單因素方差分析后，組間差異比較用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 H2S對(duì)泡沫細(xì)胞內(nèi)FC及CE濃度的影響 與泡沫細(xì)胞組相比，NaHS（10－4、10－3mol／L）處理24h或 NaHS（10－4mol／L）處理48h均顯著降低了泡沫細(xì)胞中TC、FC和CE及CE／TC水平（P＜0.05）。NaHS（10－5mol／L）處理24h和NaHS（10－4mol／L）處理12h細(xì)胞中TC、FC和CE及CE／TC水平與泡沫細(xì)胞組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

圖1 H2S對(duì)泡沫細(xì)胞ABCA1蛋白表達(dá)的影響

表3 H2S對(duì)泡沫細(xì)胞ABCA1表達(dá)的影響（，n＝5）

表3 H2S對(duì)泡沫細(xì)胞ABCA1表達(dá)的影響（，n＝5）

a：P＜0.05，與泡沫細(xì)胞組比較；b：P＜0.05，與 NaHS（10－5 mol／L）24h組比較。c：P＜0.05，與NaHS（10－5 mol／L）24h組比較；d：P＜0.05，與 NaHS（10－4 mol／L）12h組比較；e：P＜0.05，與 NaHS（10－4 mol／L）24h組比較。

組別 ABCA1mRNA相對(duì)表達(dá)水平（%）ABCA1蛋白100.00±0.00 0.15±0.02 NaHS（10－5 mol／L）24h組 103.27±3.65 0.17±0.03 NaHS（－4 mol／L）24h組 125.76±5.14abd 0.48±0.05abd NaHS（－3 mol／L）24h組 148.63±8.36abc 0.98±0.12abc NaHS（－4 mol／L）12h組 105.38±2.47 0.16±0.02 NaHS（－4 mol／L）48h組 156.79±5.96ade 0.96±0.13相對(duì)表達(dá)水平泡沫細(xì)胞組ade

2.2 H2S對(duì)泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出的影響 與泡沫細(xì)胞組相比，NaHS（10－4、10－3mol／L）處理24和48h時(shí)間和濃度依賴的方式增加泡沫細(xì)胞膽固醇流出（P＜0.05）。NaHS（10－5mol／L）處理12、24和48h及 NaHS（10－5、10－4、10－3mol／L）處理12h沒(méi)有影響泡沫細(xì)胞膽固醇流出（P＞0.05），見(jiàn)表2。

2.3 H2S對(duì)泡沫細(xì)胞ABCA1mRNA和蛋白表達(dá)的影響 與泡沫細(xì)胞組相比，NaHS（10－4和10－3mol／L）處理 24h或NaHS（10－4mol／L）處理48h均顯著上調(diào)細(xì)胞中 ABCA1mRNA和蛋白表達(dá)（P＜0.05），呈時(shí)間和濃度依賴性。NaHS（10－5mol／L）處理24h及 NaHS（10－4mol／L）處理12h細(xì)胞中ABCA1的表達(dá)與泡沫細(xì)胞組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖1和表3。

3 討 論

AS發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，至今尚未闡明。H2S具有改善血管內(nèi)皮功能、調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞凋亡和增殖、抑制血管重構(gòu)、舒張血管和抗氧化等心血管保護(hù)作用［6］。研究表明H2S具有抗AS的作用，但機(jī)制沒(méi)有完全闡明［7］。研究發(fā)現(xiàn)H2S可以延緩對(duì)ApoE基因敲除小鼠AS的進(jìn)程，減小AS斑塊［8］。本研究結(jié)果表明H2S降低了泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇和膽固醇酯的濃度，增加膽固醇的流出率。

在致病因素的作用下，單核巨噬細(xì)胞在血管內(nèi)膜下吞噬過(guò)多的膽固醇和磷脂，特別是ox－LDL，以脂滴的形式聚集在細(xì)胞內(nèi)形成泡沫細(xì)胞［9－10］。巨噬細(xì)胞攝取過(guò)多脂質(zhì)并沉積于血管內(nèi)膜下，本身是一種自我保護(hù)機(jī)制，關(guān)鍵是這些細(xì)胞攝取脂質(zhì)后能否將其代謝并轉(zhuǎn)運(yùn)出去。細(xì)胞脂質(zhì)攝取與流出的失衡是泡沫細(xì)胞形成的關(guān)鍵。ABCA1在巨噬細(xì)胞膽固醇流出和RCT的過(guò)程中發(fā)揮十分重要的作用［11］。研究發(fā)現(xiàn)H2S能下調(diào)巨噬細(xì)胞CD36mRNA和蛋白表達(dá)，減少ox－LDL攝取，抑制泡沫細(xì)胞形成［12］。那么H2S能否影響細(xì)胞RCT，而發(fā)揮抗AS的作用？本研究結(jié)果表明H2S以劑量和濃度依賴方式上調(diào)了巨噬細(xì)胞性泡沫細(xì)胞中ABCA1mRNA和蛋白的表達(dá)，并增加泡沫細(xì)胞中膽固醇流出。因此H2S抗AS的作用可能與通過(guò)上調(diào)泡沫細(xì)胞中ABCA1表達(dá)并促進(jìn)膽固醇流出有關(guān)。

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