孫 禎，黃赤兵，宋亞軍，陳益榮，李傳貴

（第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院泌尿外科，重慶 400037）

Exosome是一種起源于內(nèi)吞體系統(tǒng)并被排出胞外的膜性囊泡，直徑在30～100nm［1］，含有大量與其來(lái)源相關(guān)的特異性蛋白，并由此發(fā)揮不同的功能［2］。T淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，并且不同的亞群具有各異的免疫學(xué)功能。例如CD4＋CD25＋Terg細(xì)胞具有誘導(dǎo)免疫耐受的作用［3］；而接觸抗原活化后的效應(yīng)T細(xì)胞則是介導(dǎo)細(xì)胞毒作用的參與者。因此，作為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與功能信使的exosome將有可能是Treg細(xì)胞進(jìn)行遠(yuǎn)端免疫耐受調(diào)控及效應(yīng)T細(xì)胞上調(diào)免疫應(yīng)答的未知機(jī)制［4］。故獲得高純度和無(wú)蛋白丟失的exosome樣本是進(jìn)一步探尋其功能和組成的基礎(chǔ)。為此，本研究通過(guò)3種方法提取T細(xì)胞分泌的exosome，并比較不同方法所得樣本的差異，以找出最適提取exosome的方法，為后續(xù)的免疫學(xué)功能和蛋白質(zhì)組成的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性清潔級(jí)6～8周齡SD大鼠，購(gòu)買(mǎi)于第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器 ExoQuick Precipitation（美國(guó)SBI公司）；重水、分析純蔗糖（美國(guó)Sigma公司）；BCA試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；載破片（海門(mén)市神鷹實(shí)驗(yàn)器材廠）；超濾離心管100×103（美國(guó) Millipore公司，Amicon Ultra）；高速冷凍離心機(jī)（美國(guó) BECKMAN COULTER，Avanti J－30I，轉(zhuǎn)子JA－30.50T1）；超高速冷凍離心機(jī)（日本 Hitachi，轉(zhuǎn)子 S55A）；透射電鏡（日本 Hitachi，H－7500－TEM）；垂直電泳儀（美國(guó)Biorad公司）；影像分析掃描儀（美國(guó)Biorad公司，GS－800）。

1.2.2 細(xì)胞提取及培養(yǎng) 無(wú)菌取出大鼠的腸系膜淋巴結(jié)（Mln）于裝有10mL RPM1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）的玻璃培養(yǎng)皿中，用載破片毛玻面研磨組織得到細(xì)胞懸液，用100目篩網(wǎng)過(guò)濾后轉(zhuǎn)至15mL離心管中。1800r／min離心5min，棄上清液，用10mL磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸后小心加入預(yù)先裝有15mL淋巴細(xì)胞分離液的50mL離心管中，保持分界清楚，2500r／min離心20min，吸出云霧狀細(xì)胞，即為淋巴細(xì)胞。將培養(yǎng)用胎牛血清在4℃條件下42000r／min離心70min出去內(nèi)源性exosome，接種分離得到的T細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中，覆蓋以RPM1640培養(yǎng)基（內(nèi)含10%胎牛血清，0.1%青霉素、鏈霉素），至于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)3d，收集上清液，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 exosome制備

1.2.3.1 ExoQuick Precipitation提取法（A法） 將收集的上清利用ExoQuick Precipitation進(jìn)行提取［5］。收集細(xì)胞培上清10mL，4℃條件下，5500r／min離心15min取上清液，加入ExoQuick Precipitation 2mL，混勻后4℃過(guò)夜，3000r／min離心30min棄上清液，3000r／min離心5min棄殘存液體，100μL PBS重懸，所得懸液包含exosome。以此法收集的標(biāo)本代號(hào)為“A”。

1.2.3.2 超濾及密度梯度離心法（B法） 將收集的上清液進(jìn)行超濾及密度梯度離心法收集exosome［6］。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液50mL，4℃條件下，800r／min離心30min取上清液，10000r／min離心30min取上清液，上清液加入100×103超濾管中3000r／min離心30min進(jìn)行濃縮，將濃縮液轉(zhuǎn)移至30 g／L的蔗糖重水墊上42000r／min離心70min，取出蔗糖重水用50mL PBS稀釋后置于Amicon超濾管中3000r／min離心30min進(jìn)行濃縮，所得濾液即包含exosome。以此法收集的標(biāo)本代號(hào)為“B”。

1.2.3.3 差速離心法（C法） 將收集的上清進(jìn)行差速離心法收集exosome［7］。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清50mL，4℃條件下，800 r／min離心10min取上清液，4500r／min離心10min取上清液，10000r／min離心30min取上清液，42000r／min離心70 min取沉淀，PBS重懸后42000r／min離心70min取沉淀，100μL PBS重懸，所得懸液即包含exosome。以此法收集的標(biāo)本代號(hào)為“C”。

1.2.4 exosome的鑒定分析

1.2.4.1 形態(tài)觀察 取不同方法提取的exosome懸液30μL于載樣銅網(wǎng)上，室溫靜置1min，用濾紙從側(cè)面小心吸干液體，滴加20g／L的磷鎢酸，室溫復(fù)染1min，用濾紙從側(cè)面小心吸干液體，白熾燈下烘烤5min，透射電鏡觀察、照相。

1.2.4.2 蛋白定量 將溶解稀釋至0.5mg／mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板中，將每孔體積用PBS補(bǔ)充到20μL；取3種樣本溶液各8μL加入到上述96孔板中，分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔，加入PBS補(bǔ)充到20μL；各孔加入工作液200μL，37℃放置30min后測(cè)定蛋白濃度。

1.2.4.3 十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）檢測(cè) 按照蛋白定量結(jié)果調(diào)整至上樣終濃度相同，上樣終體積為25μL，100℃煮沸5min，加樣于上樣孔內(nèi)，濃縮膠80V，35min；分離膠100V，100min。結(jié)束后，使用0.25%考馬斯亮藍(lán)染液進(jìn)行烤染1min，立即用搖床緩慢搖晃10min，脫色液脫色至條帶明顯，使用Biorad（GS－800）圖像分析儀進(jìn)行觀察拍照。

1.2.4.4 Western blotting檢測(cè) 將進(jìn)過(guò)SDS－PAGE分離后的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉后，一抗為兔抗鼠IL－2，4℃過(guò)夜孵育。二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體，室溫孵育3h候進(jìn)行顯色并觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以表示，對(duì)蛋白質(zhì)濃度和操作時(shí)間進(jìn)行單因素方差分析并進(jìn)行Tukey顯著性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取培養(yǎng)第3天的淋巴細(xì)胞照片，顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞分布均勻，已鋪滿瓶底，細(xì)胞呈球形，核圓，胞質(zhì)少。見(jiàn)圖1。

圖1 淋巴細(xì)胞培養(yǎng)圖（×200）

2.2 透射電鏡 經(jīng)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)3種方法提取T細(xì)胞培養(yǎng)上清中的exosome均具有以下形態(tài)特征：呈類圓形囊泡，囊泡外周可見(jiàn)其膜性結(jié)構(gòu)，直徑分布于30～100nm，可以單個(gè)分布，也可聚集成群，即為exosome。圖2可見(jiàn)A、B法分離出的exosome背景清晰，exosome囊泡形態(tài)顯著，分布均勻；C方法分離得出的exosome背景污染較為嚴(yán)重，單個(gè)囊泡形態(tài)顯著者較少，多為成團(tuán)出現(xiàn)，分布不均勻。

圖2 3種方法所得exosome超微結(jié)構(gòu)圖（×93000）

2.3 操作時(shí)間比較 A方法平均耗時(shí)（14.8±1.42）h；B方法平均耗時(shí)（4.58±0.43）h；C方法平均耗時(shí)（6.75±0.53）h，A、B、C法的操作時(shí)間呈遞減趨勢(shì)，A法用時(shí)顯著多余B、C法（P＜0.05）。

2.4 蛋白定量 以BSA各級(jí)蛋白濃度對(duì)OD562處的吸光度值作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，以此得到A、B、C法提取exosome的蛋白濃度分別為：（2.18±0.09）μg／μL、（2.16±0.15）μg／μL、（1.67±0.17）μg／μL。其中 A、B法所得樣本蛋白濃度均顯著高于C法（P＜0.05）；A、B法所得樣本蛋白濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 SDS－PAGE電泳 蛋白質(zhì)電泳圖譜見(jiàn)圖3：3種方法提取的同源exosome所含蛋白質(zhì)種類豐富，且在蛋白表達(dá)強(qiáng)度上具有明顯差異。

圖3 3種方法所得樣本SDS－PAGE電泳圖

2.6 Western blotting結(jié)果 以β－actin為內(nèi)參，檢測(cè)白細(xì)胞介素2（IL－2）在3種方法提取出的exosome中的表達(dá)情況，見(jiàn)圖4。ExoQuick Precipitation提取法（A）、超濾密度梯度離心法（B）、差速離心法（C）3種方法所得樣本中均表達(dá)IL－2。

圖4 Western blotting檢測(cè)3種方法所得樣本中IL－2的表達(dá)

3 討 論

Exosome是一種可由多種細(xì)胞分泌的納米級(jí)膜性囊泡，最早是在研究紅細(xì)胞成熟時(shí)被發(fā)現(xiàn)［8］。隨著研究的進(jìn)展，還發(fā)現(xiàn)除紅細(xì)胞之外的其他多種細(xì)胞均可分泌exosome，如B細(xì)胞、T細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等［9－11］。各種細(xì)胞來(lái)源的exosome小體均具有類似的結(jié)構(gòu)：直徑30～100nm，含有與其來(lái)源密切相關(guān)的蛋白質(zhì)和功能性核酸分子［12－14］。

C法是傳統(tǒng)的exosome提取方法，采用多步離心，分層去除污染物：800r／min與4500r／min分別離心10min以去除液體中殘留細(xì)胞，10000r／min離心30min去除細(xì)胞碎片，第1次42000r／min離心70min沉淀下exosome和蛋白質(zhì)聚合物，經(jīng)過(guò)PBS重懸后進(jìn)行第2次42000r／min，70min離心，得到沉淀為exosome［7］。此方法操作步驟繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，易污染，不適合進(jìn)行大量生產(chǎn)。超濾密度梯度離心（B法）最初由Henry等［16］建立，經(jīng)過(guò)不斷演變和改進(jìn)發(fā)展至今，是由差速離心法演變而來(lái)，耗時(shí)段、成本低，并且能夠有效的去除蛋白聚合物以及細(xì)胞凋亡時(shí)產(chǎn)生的核小體碎片而獲得較高純度的exosome樣本［9］。ExoQuick Precipitation提取法（C法）是利用exosome的特異性提取試劑，根據(jù)免疫共沉淀原理進(jìn)行exosome的提取，操作簡(jiǎn)便，能夠獲得高純度的exosome樣本［5］，是1種較為新興的提取方法。本研究首次以T細(xì)胞培養(yǎng)上清作為共同樣本來(lái)源比較現(xiàn)行主要的3種exosome提取方法的操作耗時(shí)、樣本電鏡照片、樣本蛋白質(zhì)濃度、蛋白質(zhì)表達(dá)種類以及特定細(xì)胞因子的表達(dá)情況。能夠從提取步驟及結(jié)果分析層面有效的說(shuō)明3種方法的優(yōu)劣，從而可為接下來(lái)的蛋白質(zhì)組成及功能學(xué)研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。從操作耗時(shí)分析，A法耗時(shí)顯著高于B、C法。由電鏡觀察可得，C法所得樣本單個(gè)囊泡形態(tài)顯著者較少，多為成團(tuán)出現(xiàn)，分布不均勻，背景渾濁；A、B法所的樣本則exosome形態(tài)顯著，分布均勻，背景清晰，其中A法所得樣本密度高，視野中exosome囊泡數(shù)量眾多。蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)可得，A、B法所得樣本濃度顯著高于C法所得樣本。已有文獻(xiàn)報(bào)道差速離心法會(huì)導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)的丟失［5］，而本研究的結(jié)果與其一致。SDS－PAGE結(jié)果顯示，3種方法所得樣本含蛋白種類繁多。通過(guò) Western blotting檢測(cè)可知3種樣本均有IL－2的表達(dá)。綜上所述，傳統(tǒng)的差速離心法會(huì)造成exosome蛋白丟失、囊泡破損以及相互融合等現(xiàn)象；而超濾密度梯度離心法和ExoQuick Precipitation提取法則能獲得高純度、無(wú)蛋白丟失、樣本保持完好的exosome囊泡，考慮到提取成本，則B方法更適合進(jìn)行批量提取。

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