俞麗麗，李 力△，趙 丹，盧林杉，鄭英如，陳星云，李 平，周元國

（第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所：1.婦產(chǎn)科；2.第七研究室，重慶 400042）

基因印跡是一種不遵從經(jīng)典的孟德爾遺傳規(guī)律的依靠單親傳遞某些遺傳學性狀的現(xiàn)象，目前已成為遺傳學領(lǐng)域的研究熱點。其中H19作為發(fā)現(xiàn)最早的印跡基因之一，主要在人胎盤及胚胎組織中豐富表達，在成人組織中很少表達。而且有證據(jù)表明，H19在配子形成、胚胎的早期形成、著床以及生長發(fā)育過程中發(fā)揮了重要的生理功能，并與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［1］。但H19的作用機制目前仍未能完全闡明。因此，本研究利用國際常用的人滋養(yǎng)層細胞模型－－人絨毛膜上皮癌細胞系（JEG－3）作為體外實驗模型，通過基因工程技術(shù)來深入探討H19對滋養(yǎng)細胞基因表達譜的影響，以期闡明H19對滋養(yǎng)細胞生物學行為的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒 包含人全長H19cDNA重組真核表達質(zhì)粒pRc／CMV由蒙特利爾大學醫(yī)院內(nèi)分泌科Cheri.L.Deal教授惠贈?？蛰d質(zhì)粒pRC／CMV購自invitrogen公司。

1.1.2 細胞系 JEG－3細胞，為人滋養(yǎng)細胞腫瘤株，由第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科實驗室惠贈，購買于美國ATCC細胞庫。

1.1.3 主要試劑及儀器 DMEM／F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基和胎牛血清，質(zhì)粒小量提取試劑盒（OMEGA），質(zhì)粒去內(nèi)毒素純化試劑盒 D6944－1，Trizol、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒（Lipofectamine 2000），定量PCR試劑（ABI Power SYBR Green PCR Master Mix），定量PCR儀（7000Sequence Detection System）。H19基因和GAPDH基因上、下游引物均由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 JEG－3細胞的培養(yǎng) 凍存于液氮的JEG－3細胞經(jīng)復蘇后，于37℃5%CO2條件下培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)液中，經(jīng)3次傳代穩(wěn)定后，進行基因轉(zhuǎn)染。

表1 驗證基因PCR引物序列

1.2.2 質(zhì)粒的純化及鑒定 重組H19真核表達質(zhì)粒pRc／CMV－H19質(zhì)粒，先用OMEGA質(zhì)粒小提試劑盒抽提后送invitrogen公司測序。測序結(jié)果經(jīng)BLAST確證后pRc／CMVH19質(zhì)粒和空載質(zhì)粒pRc／CMV按QIAGEN試劑盒手冊操作大量抽提。

1.2.3 基因轉(zhuǎn)染和鑒定 以pRc／CMV－H19質(zhì)粒轉(zhuǎn)染JEG－3細胞，按Lipofectamine 2000手冊操作，并以空載質(zhì)粒pRc／CMV轉(zhuǎn)染JEG－3細胞為pRc／CMV轉(zhuǎn)染陰性對照，以僅加Lipofectamine 2000的JEG－3細胞為空白對照。實驗組和對照組在轉(zhuǎn)染后24h收集細胞，采用Trizol一步法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后熒光定量PCR分析H19基因表達變化。H19基因上游引物：5′－TCC CAG AAC CCA CAA CAT GAA－3′，下游引物：5′－TTC ACC TTC CAG AGC CGA TTC－3′（150bp），GAPDH 基因上游引物：5′－TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA－3′，下游引物：5′－CAC CCT GTT GCT GTA GCC AAA－3′。SYBR Green RT－PCR反應條件：50℃孵育2min，95℃2 min，95℃15s，59℃1min，40個循環(huán)。

1.2.4 芯片檢測 3組細胞采用Trizol一步法提取總RNA，經(jīng)純化后合成cDNA和生物素標記cDNA，采用Affymetrix公司生產(chǎn)的U133plus 2.0Array基因表達譜芯片，在Affymetrix Genechip Hybridization Oven640中雜交后，在 Affymetrix Fluidics Station 450中洗脫和染色，芯片結(jié)果采用Gene array Scanner30007G進行掃描。GCOS軟件讀取、處理數(shù)據(jù)。差異基因篩選標準為實驗組和對照組比值取Log2后的值即Signal Log Ratio≥1（上調(diào)）或≤－1（下調(diào)）。

1.3 熒光定量PCR驗證芯片結(jié)果 分別選取芯片結(jié)果中已知的差異基因（EPS15、DUSP5、HES1）和非差異基因（IGF2、MMP－9），采用SYBER Green熒光定量PCR方法檢測3組細胞中相關(guān)基因的mRNA的表達，驗證兩種方法是否一致。各檢測基因引物序列見表1。

1.4 熒光定量PCR檢測差異基因HES1（hairy enhancer of split 1）的表達水平 采用Trizol一步法提取重度子癇前期胎盤組織與正常晚孕胎盤組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用SYBER Green熒光定量PCR方法檢測RNA的表達水平。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料用表示，采用單因素方差分析檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 pRc／CMV－H19質(zhì)粒的測序結(jié)果 測序結(jié)果與Gene－Bank上的序列進行BLAST，結(jié)果完全正確。

2.2 各組細胞H19基因的表達 熒光定量PCR的檢測結(jié)果顯示pRc／CMV－H19質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、pRc／CMV轉(zhuǎn)染陰性對照組和空白對照組的ΔCT分別為－0.8594、4.2975、3.4284。pRc／CMV－H19質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組H19mRNA水平相對于pRc／CMV轉(zhuǎn)染陰性對照組和空白對照組高16倍以上，而pRc／CMV轉(zhuǎn)染陰性對照組和空白對照組H19mRNA水平無差異。該檢測結(jié)果與后期芯片的檢測結(jié)果是一致的。

2.3 芯片檢測結(jié)果 通過采用Affymetri：U133plus 2.0Array基因表達譜芯片共檢測了三張芯片，檢測工作均由上海生物芯片有限公司（生物芯片上海國家工程研究中心）完成，有嚴格的樣本質(zhì)檢報告以及質(zhì)控標準。結(jié)果發(fā)現(xiàn)pRc／CMV－H19質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞與空白對照組細胞相比，共有491條上調(diào)基因，664條下調(diào)基因；pRc／CMV－H19質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞與pRc／CMV轉(zhuǎn)染陰性對照組細胞相比，共有82條上調(diào)基因，220條下調(diào)基因；pRc／CMV轉(zhuǎn)染陰性對照組細胞與空白對照組細胞相比，共有409條上調(diào)基因，314條下調(diào)基因。為了獲得印跡基因H19對JEG－3細胞基因表達譜的影響，進一步優(yōu)化篩選標準：pRc／CMV－H19質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞與兩對照組細胞相同的差異基因，但必須是兩對照組之間的非差異基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有96條差異基因，其中上調(diào)基因19條，下調(diào)基因77條。見表2。

2.4 熒光定量PCR 檢測H19過表達對IGF2、HES1、EPS15、DUSP5、MMP－9基因mRNA的影響以驗證芯片數(shù)據(jù)的可靠性：除EPS15外其余基因熒光定量PCR結(jié)果與芯片相符。采用2－△△CT法計算各組目的基因相對于陰性對照組目的基因的相對表達水平，ΔΔCT＝各樣品ΔCt－陰性對照組ΔCt平均值。熒光定量PCR的檢測結(jié)果顯示H19質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后HES1、DUSP5mRNA表達較陰性對照組明顯下調(diào)，而EPS15、IGF2、MMP－9mRNA表達則無明顯改變。H19質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組HES1和DUSP5mRNA相對于陰性對照組的表達倍數(shù)分別是0.44±0.07、0.38±0.02，與陰性對照組比較，P＜0.01。即H19過表達后HES1和DUSP5mRNA表達水平分別被抑制了56%和62%，而EPS15、IGF2mRNA和 MMP－9基因表達水平與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義。空白對照組HES1、DUSP5、IGF2和 MMP－9mRNA表達相對于陰性對照組的表達倍數(shù)分別是3.16±1.13、3.89±0.08、1.95±0.37和0.15±0.02，而EPS15mRNA表達則無明顯改變。見圖1。實驗結(jié)果顯示除EPS15外其余基因熒光定量PCR結(jié)果與芯片相符。

表2 差異基因的基因分類

圖1 H19過表達對EPS15、DUSP5、HES1、IGF2、MMP－9基因mRNA表達的影響

2.5 重度子癇前期胎盤組織與正常晚孕胎盤組織HES1mRNA表達水平 重度子癇前期胎盤組織HES1mRNA相對表達倍數(shù)為0.14±0.05，正常晚孕胎盤組織HES1mRNA相對表達倍數(shù)為0.49±0.27。兩者比較，重度子癇前期胎盤組織HES1mRNA的表達水平較正常晚孕胎盤組織中HES1mRNA的表達水平明顯降低（P＜0.01）。

3 討 論

正常的基因印跡在功能上與胎兒及胎盤的發(fā)育、細胞分化和增殖等有關(guān)［2］?；蛴≯E異常（如印跡丟失、雜合性丟失、單親二倍體等現(xiàn)象）與某些特殊的遺傳性疾病及腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［3］。人H19是一種母方表達、父方沉默的印跡基因，定位于染色體11p15.5區(qū)，全長約3kb，共含有5個外顯子、4個內(nèi)含子。目前公認H19不能產(chǎn)生蛋白質(zhì)，其最終表達產(chǎn)物是RNA，并在RNA水平發(fā)揮作用。但H19的作用機制目前仍未能完全闡明。有學者認為它是原癌基因［4］，也有學者認為它是抑癌基因，因此有人認為H19在細胞的增殖、分化和侵襲方面具有雙重作用［5］。本研究以人滋養(yǎng)細胞腫瘤細胞系JEG－3為體外實驗模型，通過含人全長H19cDNA重組真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染JEG－3后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3組之間的細胞基因表達譜均存在的明顯差異。作者運用生物信息學方法進一步優(yōu)化篩選標準：pRc／CMV－H19質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞與兩對照組細胞均存在差異的基因，但這些基因必須是兩對照組之間的非差異基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有96條差異基因，其中上調(diào)基因19條，下調(diào)基因77條。這些基因共有30條為未知功能基因，66條已知功能基因主要與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、受體結(jié)合、細胞代謝、細胞發(fā)育、細胞進程和生物學調(diào)節(jié)功能相關(guān)。

胰島素樣生長因子－2（IGF2）作為與H19互為連鎖的印跡基因，位于同一條染色體上，也是人類基因組中最早被鑒定的印跡基因之一，在大部分組織中呈父系表達，母系印跡。有文獻報道H19可調(diào)控IGF2的表達，H19基因的缺失，將導致IGF2基因母系等位基因表達［6－8］。之后越來越多的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)H19、IGF2的表達水平和印跡狀態(tài)之間，H19與IGF2之間并未存在固定的聯(lián)系［9－10］。本研究前期發(fā)現(xiàn)H19過表達不引起IGF2的表達變化；同樣采用RNA干擾的方法來觀察H19對IGF2表達的影響也發(fā)現(xiàn)在滋養(yǎng)細胞中H19與IGF2之間不存在固定的聯(lián)系［11］。

HES1屬于HES基因家族，而HES基因家族又屬于抑制型bHLH（basic helix－loop－h(huán)elix）基因。HES基因編碼的蛋白為堿性螺旋－環(huán)－螺旋結(jié)合蛋白，是一類含有特征性堿性螺旋－環(huán)－螺旋結(jié)構(gòu)（bHLH）的DNA結(jié)合蛋白，在進化過程中高度保守，可通過bHLH區(qū)域直接與靶DNA或與其他bHLH蛋白結(jié)合形成無活性二聚體阻斷激活路徑而抑制轉(zhuǎn)錄，最終抑制干細胞分化而影響細胞命運。HES1基因敲除的小鼠神經(jīng)細胞在前體細胞增殖前就過早分化，結(jié)果導致神經(jīng)系統(tǒng)嚴重發(fā)育異常，如無腦畸形、眼形成異常等，在胚胎發(fā)育晚期或出生后不久即死亡［12－13］。Kunnimalaiyaan等［14］通過將HES1基因穩(wěn)定地導入H727類癌瘤細胞，使其穩(wěn)定表達，發(fā)現(xiàn)可以抑制類癌瘤細胞的增殖。Liu等［15］研究發(fā)現(xiàn)在宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌中HES1表達增強，并隨著病變加重表達逐漸增強。

在正常胎盤滋養(yǎng)細胞以及滋養(yǎng)細胞腫瘤組織中均未見HES1的研究報道，也無印跡基因H19與HES1之間關(guān)系的研究報道。經(jīng)芯片檢測的結(jié)果提示，通過定量PCR方法檢測了H19的過表達可下調(diào)JEG－3細胞HES1的表達。進一步研究表明重度子癇前期胎盤組織中HES1mRNA表達水平下調(diào)，提示HES1表達受阻時，滋養(yǎng)細胞的分化障礙導致滋養(yǎng)細胞功能異常，從而參與子癇前期的發(fā)病。

總之，本次芯片實驗結(jié)果表明印跡基因H19主要可引起轉(zhuǎn)錄調(diào)控、受體結(jié)合、細胞代謝、細胞發(fā)育、細胞進程和生物學調(diào)節(jié)相關(guān)基因的改變，從而調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細胞的生物學功能，對未知功能基因的深入研究將有助于進一步了解H19對滋養(yǎng)細胞的調(diào)控機制。

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