楊曉鯤，楊亞?wèn)|，楊桂紅，唐書謙，伍津津

（第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所皮膚科，重慶 400042）

人皮膚鱗狀細(xì)胞癌（the human shin squamous－celled carcinoma，SCC），是皮膚腫瘤中侵襲性、致死性較強(qiáng)的一類，對(duì)其研究一直都是熱點(diǎn)。以往研究者借助普通的二維細(xì)胞培養(yǎng)和鱗癌動(dòng)物模型進(jìn)行研究，本試驗(yàn)中，通過(guò)建立SCC三維培養(yǎng)模型，并進(jìn)一步篩選出具有更高侵襲性的SCC細(xì)胞亞群，并比較兩種細(xì)胞亞群之間的生物學(xué)特性，為臨床治療SCC提供重要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1～3個(gè)月雄性裸鼠40只，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所提供。

1.1.2 細(xì)胞和試劑 人表皮鱗癌細(xì)胞株A－431細(xì)胞株（TCHu188，上海細(xì)胞生物研究所），人源角質(zhì)形成細(xì)胞（KC細(xì)胞）和成纖維細(xì)胞（FB細(xì)胞）為本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)凍存?zhèn)溆?，鼠尾膠原按本科方法制備［1］；肉桂醛（Sigma公司）；注射用重組人干擾素α1b（IFNα1b）（賽若金，每支1mL∶30μg，國(guó)藥準(zhǔn)字S10960059，深圳科興生物工程有限公司）；層粘連蛋白，普通和高糖DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT粉）、表皮生長(zhǎng)因子、殼多糖、硫酸軟骨素C、透明質(zhì)酸（均為SIGMA產(chǎn)品），HEPES（美國(guó)KAI生物醫(yī)學(xué)科學(xué)公司），膠原酶D（德國(guó)寶靈曼公司）；胰蛋白酶（中國(guó)科學(xué)院新疆化學(xué)研究所）。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），二氧化碳孵箱TC2323型（SHEL LAB公司），HY－4調(diào)速多用振蕩器（江蘇金壇市中大儀器廠）；酶標(biāo)儀（Biotek ELx800，USA）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（HK97CASY－TT）。

1.2 方法

1.2.1 A431細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代 向A431細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中加入2mL 0.01mol／L的磷酸鹽緩沖液（PBS），清洗2次，倒掉培養(yǎng)基，加入0.25%胰酶4℃冷消化30min，后輕輕拍打培養(yǎng)瓶壁，加入1mL胎牛血清終止消化后按1∶2～1∶4傳代擴(kuò)增，以此獲得的A431細(xì)胞記為Ⅰ組。KC細(xì)胞和FB細(xì)胞從臨床健康成人包皮標(biāo)本獲取，并常規(guī)培養(yǎng)、傳代。

1.2.2 建立A431鱗癌細(xì)胞三維培養(yǎng)模型 參照以往研究［1］在6孔培養(yǎng)板上制作組織工程凝膠，將FB 1.5×105個(gè)細(xì)胞／孔混入凝膠中，待凝膠凝固后，再按照A4310.5×105個(gè)細(xì)胞／孔、KC 2×105個(gè)細(xì)胞／孔的比例加入凝膠中，進(jìn)行A431三維培養(yǎng)模型的建立，分為 A、B、C、D組（分別對(duì)應(yīng)5、7、10、14d），各重復(fù)2組（一組觀察鱗癌細(xì)胞浸潤(rùn)情況，另一組消化提取細(xì)胞）。為改善培養(yǎng)環(huán)境，利用振蕩器進(jìn)行振蕩培養(yǎng)；并在5、7、10、14d取出標(biāo)本，甲醛液固定，常規(guī)HE染色，鏡下觀察A431細(xì)胞浸潤(rùn)情況。之后將D組表皮層中細(xì)胞去除，加入2%膠原酶D消化，獲得浸入真皮層的A431細(xì)胞，培養(yǎng)傳代后，再次按前述各細(xì)胞數(shù)量接種于組織工程凝膠中，并分為a、b、c、d組，可再次重復(fù)2組，以獲取侵襲特性更強(qiáng)的鱗癌細(xì)胞，并將此A431細(xì)胞記為Ⅱ組（普通培養(yǎng)A431細(xì)胞為Ⅰ組）。

1.2.3 肉桂醛溶液、IFNα1b溶液及0.5%MTT液的配制肉桂醛溶液配制以0.2%二甲基亞砜溶液作為溶劑，將肉桂醛溶液和高糖無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)避光振蕩5min，0.22μm 濾膜過(guò)濾，分別配制成100μL的100、200、400μmol／L 3種 濃度，于 4℃ 保存?zhèn)溆?。IFNα1b溶 液 配制：30μg／mL IFNα1b用無(wú)血清DMEM作為稀釋劑，分別稀釋成3、2、1μg／mL濃度并置于4℃保存?zhèn)溆谩?.5%MTT液配制：將50mg MTT混合于10mL的0.01M磷酸鹽緩沖液中，振搖、溶解，0.22μm濾膜過(guò)濾，并于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 MTT法測(cè)定A431細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的A431細(xì)胞，無(wú)菌PBS洗滌3次后0.25%胰酶消化，觀察細(xì)胞收縮變圓后終止消化。1200r／min離心5min，棄上清液，加入完全培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，按2×104個(gè)細(xì)胞／100微升接種于96孔板，每孔100μL，置入37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后分別加入肉桂醛0、100、200、400μmol／L（對(duì)應(yīng)配制好的肉桂醛溶液加入量分別為0.0、12.5、25.0、50.0μL）。每組5復(fù)孔（n＝5），置入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24、48和72h后每孔加入5g／L的MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，每孔加入二甲基亞砜150μL，避光振蕩10min，酶標(biāo)儀490nm處測(cè)量光密度值。

1.2.5 裸鼠成瘤模型的建立及不同侵襲性A431細(xì)胞成瘤活性的比較 按接種A431細(xì)胞的不同分為Ⅰ、Ⅱ組，并按照接種后裸鼠生長(zhǎng)時(shí)間分為3、4、5、6周組，每組5只，胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌3次，3000r／min離心3min，棄上清液。加PBS液稀釋，制成單細(xì)胞懸液用于細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106／mL，裸鼠背部皮膚用75%乙醇進(jìn)行消毒，以1mL注射器吸取0.1mL細(xì)胞懸液，數(shù)量為2×106個(gè)，注射入裸鼠背部皮下組織，注射完畢后觀察裸鼠，無(wú)異樣反應(yīng)，繼續(xù)放于無(wú)菌飼養(yǎng)房?jī)?nèi)飼養(yǎng)，并觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，并在一定時(shí)間內(nèi)脫頸法處死裸鼠，留取腫瘤標(biāo)本，后用體積公式：V＝0.5×a×b2，（a為長(zhǎng)徑，b為短徑）計(jì)算腫瘤體積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用表示，細(xì)胞增殖抑制率等采用χ2檢驗(yàn)，組間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 A431鱗癌細(xì)胞三維培養(yǎng)模型的建立 由圖1可觀察到，作者建立的組織工程皮膚表真皮分化明顯，形成較之普通傳統(tǒng)培養(yǎng)形式不同的三維立體結(jié)構(gòu)，以標(biāo)志性的基底膜為界，上為組織工程皮膚表皮部分，而下為組織工程的真皮凝膠部分，并且從三維培養(yǎng)的第5天開(kāi)始，組織工程皮膚真皮凝膠層中可見(jiàn)到核異型性明顯的腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，浸潤(rùn)入真皮層內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量明顯增加，同時(shí)腫瘤浸潤(rùn)的廣度和深度都有所增加，到第14天時(shí)達(dá)到高峰。結(jié)果提示鱗癌細(xì)胞三維培養(yǎng)模型建立成功。

圖1 各組A431鱗癌細(xì)胞組織學(xué)觀察（HE×10）

表1 不同濃度肉桂醛對(duì)Ⅰ組、Ⅱ組A431細(xì)胞增殖的抑制率（%，，n＝20）

表1 不同濃度肉桂醛對(duì)Ⅰ組、Ⅱ組A431細(xì)胞增殖的抑制率（%，，n＝20）

aP＜0.01，與無(wú)藥物對(duì)照組比較；b：P＜0.01，與100μmol／L比較；c：P＜0.01，與200μmol／L比較。

濃度（μmol／L）24hⅠ組 Ⅱ組48hⅠ組 Ⅱ組72hⅠ組 Ⅱ組0000000100 13.15±2.12a 18.53±1.71a 21.67±1.53a 24.56±2.32aa 28.35±4.61a 35.51±4.93a 200 26.75±3.53ab 32.27±2.61ab 32.76±3.53ab 40.46±5.52ab 47.65±7.24ab 59.21±5.24ab 400 44.35±3.44abc 56.45±4.22abc 65.21±5.02abc 76.65±3.54abc 73.45±3.55abc 85.65±4.31abc

表2 不同濃度IFNα1b對(duì)Ⅰ組、Ⅱ組A431細(xì)胞增殖的抑制率（%，，n＝20）

表2 不同濃度IFNα1b對(duì)Ⅰ組、Ⅱ組A431細(xì)胞增殖的抑制率（%，，n＝20）

a：P＜0.01，與無(wú)藥物對(duì)照組比較；b：P＜0.01，與100μmol／L比較；c：P＜0.01，與200μmol／L比較。

濃度（μmol／L）24hⅠ組 Ⅱ組48hⅠ組 Ⅱ組72hⅠ組 Ⅱ組0000000100 19.75±3.16a 26.50±2.30a 23.65±7.12a 29.94±6.24a 31.65±3.23a 37.33±4.49a 200 23.46±2.17ab 31.46±3.27ab 28.45±3.52ab 34.65±3.38ab 36.45±4.26ab 40.38±3.99ab 400 27.76±3.24abc 38.34±4.25abc 37.86±2.15abc 45.25±4.65abc 45.35±6.26abc 51.65±2.37abc

2.2 肉桂醛和IFNα1b對(duì)不同侵襲性的A431細(xì)胞增殖活性的影響 隨著肉桂醛、IFNα1b濃度的增加，鱗癌細(xì)胞被抑制率也隨之增高，且Ⅰ組、Ⅱ組間對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表1。隨著藥物濃度的增加，鱗癌細(xì)胞被抑制率也隨之增高，且Ⅰ組、Ⅱ組間對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表2。接種后，Ⅱ組裸鼠形成的腫瘤較Ⅰ組體積更大，質(zhì)量更重，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表3。

表3 兩組A431細(xì)胞成瘤活性的比較（，n＝20）

表3 兩組A431細(xì)胞成瘤活性的比較（，n＝20）

a：P＜0.01，與Ⅰ組比較。

體積（mm3）組別3周 4周 5周 6周腫瘤質(zhì)量（g）Ⅰ組393±41 598±53 798±711553±1275.38±0.58Ⅱ組 379±36a 522±66a 701±82a1123±105a3.05±0.37a

3 討 論

SCC在皮膚腫瘤中發(fā)生率較高，對(duì)于它的治療方法和基礎(chǔ)研究很多，本實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用SCC A431細(xì)胞建立了SCC體外三維培養(yǎng)模型，并篩選出侵襲性更強(qiáng)的A431細(xì)胞亞群，并將這兩類細(xì)胞的生物學(xué)特性做了比較，證明了鱗癌細(xì)胞三維培養(yǎng)模型的有效性，為今后SCC的臨床治療和科研研究提供良好的體外培養(yǎng)模型。

眾所周知，目前腫瘤研究的主要手段集中于腫瘤細(xì)胞的二維培養(yǎng)、動(dòng)物荷瘤模型和自發(fā)性動(dòng)物腫瘤模型等方面，都存在著明顯的局限性，與臨床腫瘤診治往往存在偏差［2－3］。而三維培養(yǎng)，有利于種植細(xì)胞固有的生物學(xué)特性的維持［4］，可以較為真實(shí)地再現(xiàn)體環(huán)境中細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互間的作用。目前，已經(jīng)在腫瘤形態(tài)發(fā)生、侵襲性生長(zhǎng)及化療藥物的藥理毒理的研究中提供了比較有價(jià)值的研究手段［5－6］。例如，有學(xué)者將乳腺癌（SUM1315、MDA－MB－231）、前列腺癌（LNCaP）細(xì)胞株種植于聚已酸內(nèi)酯磷鹽三鈣（mPCL－TCP）、聚甲基丙稀酸－2－羥乙酯（polyHEMA）、Matrigel等支架材料中，并在三維培養(yǎng)條件下形成腫瘤團(tuán)塊［7－8］，并維持了惡性腫瘤的生物學(xué)特性［9－10］。

在本次實(shí)驗(yàn)中，利用復(fù)方殼多糖真皮基質(zhì)凝膠這一三維培養(yǎng)支架為基礎(chǔ)，本研究成功地建立了SCC體外三維培養(yǎng)模型，這與目前腫瘤侵襲性研究采用的細(xì)胞侵襲測(cè)定裝置系統(tǒng)如CytoSelect系統(tǒng)［11］、聚碳酸酯濾器穿壁系統(tǒng)［12］相比，具有明顯的優(yōu)勢(shì)，可以真實(shí)反映在體情況下腫瘤突破表皮層而進(jìn)入真皮層的失衡過(guò)程，同時(shí)能夠獲得這一類鱗癌細(xì)胞亞群。經(jīng)過(guò)肉桂醛和IFNα1b對(duì)皮膚鱗癌細(xì)胞的增殖抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著藥物濃度的增加，鱗癌細(xì)胞被抑制率也隨之增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其中肉桂醛在濃度為400μmol／L、作用時(shí)間為72h時(shí)，對(duì)兩組細(xì)胞的抑制率分別達(dá)到（85.65±4.31）%和（73.45±3.55）%。而IFNα1b在濃度為400μmol／L、作用時(shí)間為72h時(shí)，對(duì)兩組細(xì)胞的抑制率則分別達(dá)到了（51.65±2.37）%和（45.35±6.26）%，同時(shí)這兩組實(shí)驗(yàn)分組細(xì)胞之間比較，相同濃度藥物和相同藥物作用時(shí)間對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。另外，兩種不同侵襲特性的細(xì)胞亞群的成瘤特性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

綜上所述，本研究體外構(gòu)建鱗癌細(xì)胞三維培養(yǎng)模型是成功的，通過(guò)此模型，也能夠篩選出侵襲性更強(qiáng)的鱗癌細(xì)胞，這對(duì)構(gòu)建其他皮膚惡性腫瘤的三維培養(yǎng)模型、治療藥物篩選與評(píng)價(jià)都有重要的理論和實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)價(jià)值。至于如何維持此種腫瘤三維培養(yǎng)模型的穩(wěn)定性，以及本次研究中的皮膚鱗癌細(xì)胞侵入真皮層的具體機(jī)制，需要在今后的實(shí)驗(yàn)工作中繼續(xù)探討。

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