徐 超，李苗云，馮松凱

（1.河南出入境檢驗檢疫局，河南鄭州450003；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南鄭州450002）

在牛、羊等動物皮毛中可以攜帶藍舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）、口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV）、山羊痘病毒（Goatpox virus，GPV）、綿羊痘病毒（Sheeppox virus，SPPV）、牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）等5種病毒。這幾種病毒通過皮毛傳播的風(fēng)險較高，動物感染后，病死率高，并將迅速形成暴發(fā)和流行趨勢，對家畜和皮毛相關(guān)從業(yè)人員健康造成重大危害。目前，我國已經(jīng)成為世界上最大的皮毛進口國，進口皮張來源廣泛，進出口批次量大頻繁，急需一種能對皮毛攜帶病毒高通量、快速篩查的方法。但迄今為止，國內(nèi)外只有少量對皮毛攜帶一種或兩種病毒檢測方法的研究，檢測方法主要依靠經(jīng)典的血清學(xué)方法和PCR技術(shù)［1-4］，已經(jīng)無法適應(yīng)對進口皮毛進行快速、大批量篩查檢測的要求。為此，本研究采用基因芯片技術(shù)，根據(jù)BTV、FMDV、GPV、SPPV和BVDV等5種病毒的特異性序列設(shè)計多條引物和探針，研究同時檢測5種病毒的基因芯片檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV），綿羊痘病毒（Sheeppox virus，SPPV），山羊痘病毒（Goatpox virus，GPV）HN-1株，偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）HN-3株，豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）HN-2株，禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）HN-1株，新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）HN-5，藍舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）和O型口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus serotype O，F(xiàn)MDV／O），均由河南出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心微生物實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 MasterMix Taq酶、TIANscript M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，100bp DNA Marker，TIANprep Mini普通質(zhì)粒小提試劑盒，TIANgel Midi普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；DNA Maker DL 1 500和DL 600，購自北京索萊寶科技有限公司；MiniBEST病毒核酸提取試劑盒，pMDTM18-T Vector試劑盒，X-Gal，IPTG，EcoRⅠ酶和HindⅢ酶，購自寶生物工程（大連）有限公司；藍舌病病毒（BTV），口蹄疫病毒（FMDV），山羊痘病毒（GPV），綿羊痘病毒（SPPV），牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）核酸檢測試劑盒購自廣州維伯鑫生物科技有限公司；晶芯○R基因芯片點樣液、光學(xué)級氨基基片，購自博奧（北京）生物有限公司。

1.1.3 儀器 SmartArrayerTM48芯片點樣儀，BioMixerTMⅡ芯片雜交儀，晶芯SlideWasher芯片洗干儀，晶芯LuxScanIM10K芯片掃描儀，博奧北京生物有限公司生產(chǎn)；LabCycler Standard梯度PCR儀，德國SENSO公司生產(chǎn)；BioSpec-nano微量核酸蛋白儀，日本島津公司生產(chǎn)；GBOX-HR-E-M型全自動凝膠成像分析系統(tǒng)，英國昊維特公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針的設(shè)計 在NCBI上查找BTV、FMDV、GPV、SPPV、BVDV等5種病毒的基因組序列并進行序列分析。選擇GenBank登錄號為 GU954426.1，GU125646.1，EF517961.1，AY077834.1和GU395536.1作為參考序列，使用Prime 5.0軟件分別設(shè)計5種病毒的多重PCR引物和相應(yīng)的寡核苷酸探針。每種病毒的上游引物5′端標(biāo)記TAMARA熒光基團。探針長度小于35bp的探針5′端加T至35bp。引物和探針的合成、標(biāo)記均由寶生物工程（大連）有限公司完成，具體序列見表1。

表1 基因芯片檢測引物和探針序列Table 1 Primers and probe sequences of the gene chip detection

1.2.2 5種病毒目的基因的克隆和鑒定 參照MiniBEST核酸提取試劑盒說明書提取BTV、FMDV、BVDV、GPV和SPPV病毒核酸，用表1的引物分別進行PCR擴增?；厥漳康腜CR產(chǎn)物，TA克隆于pMD18-T質(zhì)粒。挑選陽性重組體，用EcoRⅠ和HindⅢ單、雙酶切鑒定，并進行序列測定。

1.2.3 基因芯片檢測方法的建立和優(yōu)化

1.2.3.1 基因芯片的制備 以晶芯○R基因芯片點樣液稀釋各探針至終濃度為30μmol／L，用Smart-ArrayerTM48芯片點樣儀將各探針陣列點樣于空白基片。每張基片設(shè)12個矩陣，每個矩陣為11×11陣列。矩陣布局為：第1行和第1列為點樣質(zhì)控探針，各11個重復(fù)點；第2行和第11行為雜交質(zhì)控探針，各10個重復(fù)點；第10行依次為點樣液和空白對照，各5個重復(fù)點；第3行前5個探針點為BTV探針1；第5行前5個探針點為FMDV探針1；第7行前5個探針點為GPV探針3，后5個探針點為SPPV探針3；第8行前5個探針點為BVDV探針3，其他位置為未檢測出陽性信號點樣探針點。點樣完畢，將制備的芯片80℃固定探針2h～3h后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 多重PCR方法的建立 分別提取5種病毒核酸，以BTV、FMDV、BVDV病毒核酸為模板，建立三重RT-PCR方法，采用25.0μL反應(yīng)體系。反應(yīng)體系為：逆轉(zhuǎn)錄酶1.0μL，2×TaqPCR MasterMix 12.5μL，上游引物各（20μmol／L）0.5μL，下游引物各（20μmol／L）0.5μL，模板各2.0μL，補水至25.0μL。反應(yīng)條件為：42℃反轉(zhuǎn)錄30min；94℃預(yù)變性5min；94℃1min，55℃1min，72℃1 min，共30個循環(huán)；72℃延伸10min。以GPV、SPPV病毒核酸為模板，建立雙重PCR方法，采用25.0μL反應(yīng)體系，雙重PCR反應(yīng)體系為：2×TaqPCR MasterMix 12.5μL，上游引物（20μmol／L）各0.5μL，下游引物（20μmol／L）各0.5μL，模板各2.0μL，補水至25.0μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃1min，43℃1min，72℃1min，共30個循環(huán)；72℃延伸10min。

1.2.3.3 基因芯片的雜交與洗滌 取42℃預(yù)熱的含470mL／L甲酰胺的雜交液8μL（1 000mL／L甲酰胺3.75μL、20×SSC 2.25μL、100g／L SDS 0.3 μL、50× Denhardt’s 1.5μL，水0.2μL）與7μL PCR產(chǎn)物混勻，95℃變性10min，迅速冰浴5min。參照晶芯○R基因芯片雜交盒說明，將雜交樣品點加到基因芯片每個陣列中。在芯片雜交儀中42℃、5 RPM搖轉(zhuǎn)雜交4h。雜交完畢，在芯片清洗儀中使用洗液Ⅰ（2× SSC，20g／L SDS）42℃振蕩洗滌3 min，重復(fù)3次；洗液Ⅱ（0.2×SSC）洗滌3次；超純水清洗2次后，300r／min離心甩干后備檢。

1.2.3.4 病毒基因芯片掃描與分析 預(yù)熱芯片掃描儀，選擇Cy3通道掃描雜交的基因芯片，Lux-Can3.0軟件記錄、分析熒光信號強度。

1.2.3.5 基因芯片雜交液和雜交時間的優(yōu)化 選擇不同甲酰胺濃度的4種雜交液，參照1.2.3.3方法以病毒PCR產(chǎn)物與制備的基因芯片分別雜交30min、1 h、2h和4h，雜交過夜，掃描、記錄雜交信號，根據(jù)雜交信號的強度選擇最佳雜交條件。雜交液配方為：雜交液a（配方見1.2.3.3）、雜交液b（3× SSC、2g／L SDS、250g／L甲酰胺、5×Denhardt’s）、雜交液c（5×SSC、25g／L甲酸胺、2g／L SDS）和雜交液d（20×SSC 1.5μL，100g／L SDS 0.25μL）。

1.2.4 特異性試驗 MiniBEST病毒核酸提取試劑盒分別提取1.1材料中9種病毒核酸。使用表1中病毒特異性引物參照方法1.2.2對9種病毒進行擴增后，PCR產(chǎn)物分別與制備基因芯片雜交，觀察、記錄結(jié)果。

1.2.5 敏感性試驗 用微量核酸蛋白儀分別測定BTV、FMDV、GPV、SPPV、BVDV等5種病毒重組質(zhì)粒濃度，用超純水做100倍梯度稀釋，共做5個稀釋度，按照方法1.2.2擴增后，與制備的基因芯片雜交，研究基因芯片的敏感性。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗 以BTV、GPV和BTV、GPV、SPPV三重PCR產(chǎn)物分別與4℃避光1個月、2個月、4個月和6個月的基因芯片雜交，了解制備的病毒基因芯片的穩(wěn)定性。

1.2.7 方法對比試驗 選擇151份皮毛樣品，隨機添加構(gòu)建的5種病毒質(zhì)粒，室溫條件下放置12h～24h，采用酚氯仿法提取皮毛樣品中的核酸，按照

1.2.3.3 步驟與制備的病毒基因芯片進行雜交，同時用維伯鑫病毒核酸檢測試劑盒進行平行檢測，與病毒基因芯片檢測結(jié)果進行比較。

2 結(jié)果

2.1 病毒重組質(zhì)粒克隆和鑒定結(jié)果

分別提取BTV、FMDV、GPV、SPPV和BVDV等5種病毒核酸，PCR擴增后，20g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳條帶大小分別為221、136、256、157、214 bp，結(jié)果和設(shè)計的擴增目的片段大小一致（圖1）。對陽性克隆質(zhì)粒鑒定發(fā)現(xiàn)，EcoRⅠ和HindⅢ單、雙酶切片段大小與設(shè)計擴增片段大小一致。測序分析發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的BTV、FMDV、GPV、SPPV和BVDV的重組質(zhì)粒與病毒參考序列高度同源，同源性分別為98%、96%、98%、96%、96%，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 5種病毒PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of the 5viruses

2.2 多重PCR擴增結(jié)果

提取5種病毒陽性克隆質(zhì)粒為模板，進行BTV、FMDV、BVDV三重RT-PCR擴增，產(chǎn)物大小分別221、136、214bp，與設(shè)計目的片段大小一致（圖2）；建立的GPV、SPPV雙重PCR產(chǎn)物電泳條帶大小分別為256bp、157bp，預(yù)期設(shè)計電泳條帶大小一致（圖3）。

2.3 基因芯片方法建立和優(yōu)化

2.3.1 雜交探針篩選 依據(jù)基因芯片雜交特異性和敏感性試驗結(jié)果中各病毒檢測探針熒光信號強度，篩選出檢測5種病毒特異性寡核苷酸探針，BTV探針1、FMDV探針1、GPV探針3、SPPV探針3、BVDV探針3。

2.3.2 基因芯片雜交條件優(yōu)化 分別選擇4種不同的雜交液和不同的雜交時間，參照1.2.3.3方法以BTV PCR產(chǎn)物與基因芯片雜交，根據(jù)雜交信號的強度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，選擇雜交液a，在42℃、5RPM條件下雜交4h雜交信號最強。

圖2 BTV、FMDV、BVDV三重PCR擴增結(jié)果Fig.2 Triplex PCR amplification results of BTV，F(xiàn)MDV and BVDV

2.4 方法的特異性試驗

以提取的9種病毒核酸為模板，PCR擴增后，每種病毒的擴增產(chǎn)物分別與制備基因芯片雜交。發(fā)現(xiàn)擴增的BTV、FMDV、GPV、SPPV和BVDV產(chǎn)物在相應(yīng)檢測探針位點出現(xiàn)綠色熒光信號，擴增PRV、PRRS、AIV、NDV的未出現(xiàn)雜交信號（圖4）。結(jié)果表明，各病毒探針之間無交叉反應(yīng)，制備的芯片具有很強的特異性。

圖3 GPV、SPPV雙重PCR擴增結(jié)果Fig.3 Duplex PCR amplification results of GPV and SPPV

2.5 方法的敏感性試驗

用微量核酸蛋白儀測定BTV、FMDV、GPV、SPPV和BVDV陽性重組質(zhì)粒濃度。以倍比稀釋的核酸為模板，按照1.2.3.3方法與基因芯片進行雜交。結(jié)果表明，病毒基因芯片可檢測到BTV、FMDV、GPV、SPPV、BVDV陽性雜交信號核酸最低濃度分別約為20、10、10、10、20拷貝。

2.6 方法的穩(wěn)定性試驗

與4℃避光保存的病毒基因芯片進行雜交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三組病毒PCR產(chǎn)物與至少保存6個月的病毒基因芯片雜交仍能出現(xiàn)陽性熒光信號。將陽性雜交芯片在室溫條件下避光保存3個月，5個月和6個月，結(jié)果發(fā)現(xiàn)保存6個月雜交芯片仍有很強的熒光信號。

圖4 病毒基因芯片檢測特異性結(jié)果Fig.4 Specificity of microarray in detecting viral pathogens

2.7 方法比對結(jié)果

用酚氯仿法從放置24h構(gòu)建的模擬陽性皮毛樣品中提取病毒核酸，按照1.2.3.3方法與制備的基因芯片進行雜交后。皮毛樣品2號芯片檢測結(jié)果為BTV、FMDV和BVDV陽性，皮毛樣品26號芯片檢測結(jié)果為BTV和GPV陽性，皮毛樣品32號芯片檢測結(jié)果為FMDV陽性（圖5）。用維伯鑫5種病毒核酸檢測試劑盒分別對皮毛樣品2號、26號和32號核酸進行檢測，結(jié)果一致（圖6）。對151份陽性皮毛樣品檢測結(jié)果和維伯鑫5種病毒核酸檢測試劑盒檢測結(jié)果檢測符合率為100%。

圖5 病毒基因芯片檢測皮毛樣品結(jié)果Fig.5 Results of microarray in detecting fur samples

圖6 維伯鑫病毒檢測試劑盒檢測皮毛樣品結(jié)果Fig.6 Results of Vipoyion specific kit in detecting fur samples

3 討論

在牛、羊等動物皮毛攜帶的常見病毒中，BTV、FMDV、GPV和SPPV屬于動物高風(fēng)險疫情疫病病毒，BVDV屬于動物中等風(fēng)險疫情疫病病毒。這幾種病毒通過皮毛及其相關(guān)制品傳播的風(fēng)險較高，動物一旦感染，病死率較高，并且極難消除，一旦形成暴發(fā)和流行趨勢，將對我國畜牧業(yè)以及經(jīng)濟發(fā)展造成重大影響，同時對家畜和皮毛相關(guān)從業(yè)人員健康造成重大危害。我國作為進口動物皮毛及其制品最多的國家，這5種病毒一旦傳入我國，將對我國對外貿(mào)易和畜牧業(yè)發(fā)展產(chǎn)生重大打擊，因此需要加強對進口皮毛及其制品攜帶病毒的檢測。目前，對皮毛中攜帶病毒檢測依然使用傳統(tǒng)的技術(shù)方法，主要依靠血清學(xué)方法和PCR技術(shù)，這些方法難以實現(xiàn)對皮毛樣品的高通量檢測，也不可能對攜帶的病毒進行快速篩選。本研究采用熒光標(biāo)記5種病毒的上游引物，在多重PCR的基礎(chǔ)上建立動物皮毛中攜帶5種病毒的基因芯片檢測技術(shù)。該方法能夠同時對5種病毒進行檢測，特異性強，靈敏度高，可以實現(xiàn)高通量對皮毛樣品的快速診斷，適合進出境檢驗檢疫部門批量樣品檢測的需求。

在基因芯片方法建立的過程中，探針的設(shè)計和選擇至關(guān)重要。使用寡核苷酸片段與標(biāo)記的目的片段雜交是一種常見的芯片檢測技術(shù)平臺。寡核苷酸探針在病毒核酸序列中的位置，探針的長度以及Tm值都會影響芯片檢測的特異性、敏感性和雜交信號的強度［5-7］。相關(guān)的報道表明15bp～18bp短核苷酸探針可以區(qū)分親緣關(guān)系較近的病毒。本研究考慮到探針在玻璃基片上的空間位租效應(yīng)，將堿基長度不到35bp的探針在其5′端增加T堿基至35 bp。試驗的結(jié)果也證實，該方法設(shè)計的寡核苷酸探針特異性好，熒光信號強于未加T堿基的其他探針。在基因芯片雜交過程中，雜交液中甲酰胺濃度、雜交溫度以及雜交時間三者緊密結(jié)合，共同影響著基因芯片雜交的特異性和敏感性。不適當(dāng)?shù)碾s交條件影響芯片雜交信號的強度，甚至出現(xiàn)假陽性雜交信號［8-9］。一般首先選擇當(dāng)雜交液中含500mL／L甲酰胺時，在42℃條件下進行雜交反應(yīng)。本研究選擇4種不同濃度甲酰胺雜交液進行優(yōu)化，同時對雜交溫度以及雜交時間進行優(yōu)化，最終確定基因芯片的最佳雜交條件，檢測最高靈敏度達到約20個拷貝數(shù)。

盡管基因芯片技術(shù)因其高通量、微型化以及自動化等方面的優(yōu)越性而受到廣泛的關(guān)注［10-12］，但是作為一種新興技術(shù)還存在著許多亟待解決的問題，如由于該技術(shù)具有很高的敏感性，對雜交環(huán)境（雜交條件以及實驗環(huán)境）有很高的要求，同一種基因芯片類型，在不同的試驗環(huán)境中其特異性和敏感性不同，在本實驗室條件下，前期的雜交試驗當(dāng)中遇到過類似的問題?？傊驹囼灲⒌幕蛐酒瑱z測方法能夠有效的檢測動物皮毛中攜帶的5種病毒，同時該技術(shù)對于環(huán)境以及其他臨床樣品中病毒的污染和傳播檢測提供了一個技術(shù)平臺。

［1］ Bora D P，Venkatesan G，Bhanuprakash V，et al.TaqMan real-time PCR assay based on DNA polymerase gene for rapid detection of Orf infection［J］.J Virol Meth，2011，178（1-2）：249-252.

［2］ Batten C A，Bachanek-Bankowska K，Bin-Tarif A，et al.Bluetongue virus：European Community inter-laboratory comparison tests to evaluate ELISA and RT-PCR detection methods［J］.Vet Microbiol，2008，129（1-2）：80-88.

［3］ Stenfeldt C，Belsham G J.Detection of foot-and-mouth disease virus RNA in pharyngeal epithelium biopsy samples obtained from infected cattle：Investigation of possible sites of virus replication and persistence［J］.Vet Microbiol，2012，154（3-4）：230-239.

［4］ Dubovi E J.Laboratory diagnosis of bovine viral diarrhea virus［J］.Biologicals，2012，6（4）：1-6.

［5］ Southern E，Mir K，Shchepinov M.Molecular interactions on microarrays［J］.Nat Gene，1999，21（1）：5-9.

［6］ Ratushna V J，Weller，Gibas C.Secondary structure in the target as a confounding factor in synthetic oligomer microarray design［J］.BMC Genomics，2005，6（1）：31.

［7］ Tian J，Ma K，Saaem I.Advancing high-throughput gene synthesis technology［J］.Molecular Bio Systems，2009，7（5）：714-722.

［8］ Guo Z，Guilfoyle R A，Thiel A J，et al.Direct fluorescence analysis of genetic polymorphisms by hybridization with oligonucleotide arrays on glass supports［J］.Nucleic Acids Res，1994，22（24）：5456-5465.

［9］ Rodaree K，Maturos T，Chaotheing S，et al.DNA hybridization enhancement using piezoelectric microagitation through a liquid coupling medium［J］.Lab on a Chip，2011，6（11）：1059-1064.

［10］ Brown P O，Botstein D.Exploring the new world of the genome with DNA microarrays［J］.Nat Gene，1999，21（1）：33-37.

［11］ Yoo S M，Lee S Y.Diagnosis of pathogens using DNA microarray［J］.Rec Patents on Biotechnol，2008，2（2）：124-129.

［12］ Huguenin A，Moutte L，Renois F.Broad respiratory virus detection in infants hospitalized for bronchiolitis by use of a multiplex RT-PCR DNA microarray system［J］.J Med Virol，2012，84（6）：979-985.