張 冰，張煥容，2＊，湯 承，2，王 永

（1.西南民族大學生命科學與技術學院，四川成都610041；2.動物醫(yī)學四川省高等學校重點實驗室，四川成都610041）

藏系綿羊（Tibetan sheep）是我國三大原始綿羊品種之一，是高原地區(qū)分布最廣、數(shù)量最多的畜種之一，長期繁衍生息在青藏高原及其毗鄰的四川、云南、甘肅的高寒牧區(qū)，一般生活在海拔3 000m以上，是長期自然和人工培育選擇下形成的一個地方品種［1］。也是藏民族主要的生產(chǎn)資料和生活來源之一。

綿羊的沙門菌病（Salmonellosis）主要由鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium）、羊流產(chǎn)沙門菌（Salmonella abortusovis）和都柏林沙門菌（Salmonella dublin）等引起的，并且沙門菌的許多血清型可使人感染，發(fā)生食物中毒和敗血癥等，是重要的人畜共患病［2］。綿羊的沙門菌感染，不分年齡、性別和品種。以斷奶或斷奶不久的羊較新生羔羊更易感。成年羊中，年輕羊比老齡羊更容易感染，臨床上以血性下痢和懷孕母羊流產(chǎn)為特征。羊群暴發(fā)一次，一般持續(xù)時間為10d～15d，流產(chǎn)率和病死率可達60%［3］。另外，隨著分子生物學研究的深入，人們對細菌的毒素、侵襲素與毒力島等毒力因子的認識也在不斷的深入，沙門菌的侵襲蛋白（invasion protein，inv）是由invA、invB、invC、invD和invE等一組基因編碼，其中invA為沙門菌的主要毒力因子，高度保守，幾乎存在于所有血清型沙門菌中，其編碼吸附和侵襲上皮細胞表面蛋白，決定沙門菌對腸黏膜細胞的侵襲力，與其致病性密切相關［4］。

普通的大腸埃希菌并不導致動物患病，但有些大腸埃希菌在漫長的進化過程中由于某種原因獲得了毒力基因，因此具備了致病能力。致病性大腸埃希菌引起的大腸桿菌病是一類多種動物共患的傳染病，尤其是幼齡動物多發(fā)。因致病性大腸埃希菌的血清型不同，表現(xiàn)的病理過程和臨床癥狀也不一致。一般以腸炎多見，有時還可引起敗血癥和毒血癥，引起動物死亡，或者嚴重影響幼畜生長發(fā)育，并且大腸桿菌病多與其他疾病并發(fā)，給畜牧業(yè)發(fā)展造成重大損失［5］。產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC）就是其中一種能引起人畜共患病的細菌，可以引起一系列的人類疾病，包括水樣腹瀉（watery diarrhea）、出血性腸炎（hemorrhagic colitis，HC）、血小板減少性紫癜（thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP）、溶血性尿毒綜合征（hemolytic uremic syndrome，HUS）。由STEC引起的消化道疾病在世界各地都有暴發(fā)，這一類病原菌已成為威脅人類健康的重要致病菌［6-9］。STEC能夠產(chǎn)生類志賀毒素（Shiga-like toxins，Stx），包括Stx1和Stx2兩種類型，Stx1的基因序列相對保守，目前已報道的有Stx1c（Slt1ox3／Stx1ox3）、Stx1d、Stx1v51／Stx1v52 等［10］。Stx2 基因具有多種亞型包括Stx2c（Stx2vha，Stx2vhb，Stx2vhd）、Stx2d（Stx2d-ount，Stx2d-ox3a，Stx2do111）、Stx2e、Stx2f至少10余種，因Stx基因具有不同的亞型，它們能夠結(jié)合的受體也不同，因此它們感染的對象和致病特征也各不相同［11-12］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 采自四川省紅原縣外觀健康的藏系綿羊肛門拭子19份，低溫運送至實驗室。

1.1.2 主要試劑 緩沖蛋白胨水（BPW）、TTB增菌液、SS瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和XLD培養(yǎng)基，購自杭州微生物試劑有限公司；DNA Marker DL 2 000購自Tiangen公司；EX-TaqDNA聚合酶、dNTP、pMD19-T vector試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；AXY prepTM DNA膠回收試劑盒購自Axygen公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 陽性菌株 產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌陽性菌株O157和沙門菌陽性菌株由西南民族大學生命科學與技術學院動物醫(yī)學實驗室保存。

1.2 沙門菌的分離鑒定

1.2.1 預增菌 低溫保存運送至實驗室的19份藏系綿羊肛門拭子分別置于10mL BPW增菌液中于36℃±1℃培養(yǎng)8h～18h。

1.2.2 增菌 取1mL預增菌液轉(zhuǎn)接于10mL TTB增菌液內(nèi)，于42℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。

1.2.3 分離培養(yǎng) 用接種環(huán)取增菌液，分別劃線接種于SS瓊脂平板和XLD平板，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，觀察各平板上生長的菌落，挑取SS平板上灰白色、半透明、圓珠狀、邊緣整齊、光滑濕潤、中心黑色，中等大小的菌落3個～5個或透明，針尖大小的菌落和XLD平板上呈粉紅色，帶或不帶黑色中心的菌落3個～5個，革蘭染色，鏡檢。然后將典型菌落分別劃線接種于麥康凱平板于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，觀察平板上生長的菌落，挑取3個～5個細小無色典型菌落，劃線接種于SS瓊脂平板36℃±1℃培養(yǎng)24h進一步純化。

1.2.4 大腸埃希菌的分離鑒定 在上述1.2.3的SS瓊脂平板上釣取紅色菌落和XLD平板上釣取黃色菌落各3個～5個，經(jīng)革蘭染色，鏡檢。然后將典型菌落分別劃線接種于麥康凱平板于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，觀察平板上生長的菌落，挑取麥康凱平板上紅色典型菌落接種到伊紅美藍培養(yǎng)基上于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，觀察平板上生長的菌落，培養(yǎng)后取紫黑色并帶金屬光澤的典型菌落劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，36℃±1℃培養(yǎng)24h進一步純化。

1.2.5 沙門菌和產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌的PCR鑒定

1.2.5.1 沙門菌的PCR鑒定 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的沙門菌invA基因的保守基因序列和國內(nèi)外參照文獻［13］合成引物如下：invA-1：5′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3′，invA-2：5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′，預期擴增片段長度為284bp，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。挑取純化好的單個沙門菌菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中37℃ 過夜培養(yǎng)后作為模板。反應體系為10×PCR buffer 2.0μL，10 mmol／L dNTPs 2.5μL，Taq酶0.5μL，模板量為1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，滅菌ddH2O 17μL，總體積25μL，然后進行PCR反應。PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃預變性5min；94℃45s；60℃45s；72℃1min，依次進行30個循環(huán)；72℃10min。用20 g／L瓊脂糖凝膠電泳分析，膠回收PCR產(chǎn)物、克隆并測序。

1.2.5.2 產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌雙重PCR鑒定根據(jù)國內(nèi)外參考文獻合成產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌Stx1和Stx2的引物（表1），引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1 產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌的引物信息Table 1 Primer information of Shiga toxin-producing Escherichia coli

純化好的產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌經(jīng)LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后作為模板。25μL雙重PCR反應體系為：TaqDNA聚合酶（5U／μL）0.15μL，MgCl22.5μL（250mmol／L），10×PCR buffer 2.5μL，dNTP 2.5μL （2.5mmol／L），STX1上、下游引物（10μmol／L）各 0.6μL，STX2 上、下游引物 （10 μmol／L）各0.7μL、菌液模板2μL，ddH2O補足25 μL。PCR循環(huán)參數(shù)：94℃ 預變性5min；94℃30 s；58℃40s；72℃1min，依次進行35個循環(huán)；72℃10min。用20g／L瓊脂糖凝膠電泳分析，膠回收PCR產(chǎn)物、克隆并測序。

1.2.6 基因序列同源性分析 由上海生工生物工程技術服務有限責任公司測序，將測序結(jié)果進行同源性分析并運用MEGA5.05生物軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果

2.1 沙門菌的分離與PCR鑒定結(jié)果

從19份藏系綿羊糞便拭子中分離出沙門菌1株，革蘭染色符合相應菌屬的特征。PCR擴增出約300bp的特異性條帶（圖1）。

2.2 大腸埃希菌的分離與PCR鑒定結(jié)果

共分離出13株大腸埃希菌，經(jīng)產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌PCR鑒定，其中有4株能擴增出目的條帶，這4株中3株只檢測出了Stx1基因片段，1株只檢測出了Stx2基因片段（圖2）。

圖1 沙門菌分離株的PCR檢測結(jié)果Fig.1 PCR amplification of invA gene of isolated Salmonella

圖2 產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌的PCR檢測結(jié)果Fig.2 PCR amplification of stx1and stx2genes from isolated Escherichia coli strains

2.3 基因同源性分析結(jié)果

應用NCBI上的BLAST和DNAMAN軟件分析沙門菌分離株invA基因片段與GenBank上登錄的沙門菌的invA基因同源性高達99.8%，4株產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌分離株與GenBank上登錄的產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌的stx1和stx2基因同源性都大于95%。

由圖3可知，沙門菌分離株S19invA基因片段與豪頓沙門菌（S.entericasubsp.houtenae）、薩拉姆沙門菌（S.entericasubsp.salamae）、甲型副傷寒沙門菌（S.paratyphi）、雞白痢沙門菌（S.pul-lorum）、雞沙門菌（S.gallinarum）和森夫頓堡沙門菌（S.senftenberg）所含有的invA基因片段在進化樹同一枝上，表明S19是沙門菌，但其血清型有待進一步鑒定，同時也說明了invA基因具有較高的保守性，可以作為多種血清型沙門菌檢測的首選基因。

由圖4進化樹可以看出，產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌分離株（S6、S8、S11）具有相同的產(chǎn)志賀毒素基因stx1A和stx1B，S3株只含有stx2A和Sstx2B基因，與其他3株（S6、S8、S11）分離株產(chǎn)志賀毒素基因stx1同源性較低。

圖3 沙門菌分離株S19與NCBI上登錄的主要沙門菌菌株invA基因核苷酸序列進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Salmonella S19isolates based on partical invA gene sequences in NCBI database

圖4 產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌分離株與NCBI上登錄的主要產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌菌株stx1和stx2基因核苷酸序列進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of Shiga toxin-producing Escherichia coli isolatas based on partical stx1and stx2gene sequences in NCBI database