劉春燕，張 珍，易秋艷，劉艷清，王昕怡，盧 斌，王英之杰，邵加慶

(本文編輯:張仲書; 英文編輯:王建東)

銀杏葉提取物EGb761是目前國內外治療缺血性心腦血管病中的常用藥物，在對合并糖尿病的心腦血管疾病的臨床和基礎研究中，有學者發(fā)現(xiàn)EGb761能顯著改善血糖水平［1-2］、保護胰島 β 細胞［3］，這為糖尿病的治療提供了一種新的治療手段，但其防治糖尿病的機制尚未明確。本研究采用db/db小鼠，通過觀察EGb761干預對胰島分泌功能和胰島內煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶表達水平的影響，探討EGb761改善糖尿病的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物 選取10只8周齡清潔級雄性C57BL/KsJ-db/db小鼠［許可證號SCXX(蘇)2007-0012］，體重約20～25 g，喂養(yǎng)于清潔屏障設施內，環(huán)境溫度保持在23℃，12～12 h亮暗周期，自由攝取食物和飲水。動物的處置均遵循實驗動物看護原則(NIH Publication No.85-23，修訂于1985年)。

1.2 方法 將10只db/db小鼠隨機分為觀察組(EGb761組)、糖尿病對照組(db/db組)，每組各5只，分別給予8周的EGb761［GINATON(金納多)，德國的施瓦伯制藥集團］，100 mg/(kg·d)和安慰劑(5%阿拉伯膠)灌胃，另選取5只同周齡同窩出生的db/m小鼠作為非糖尿病對照組(db/m組)，給予安慰劑灌胃。

1.3 實驗儀器、材料 血糖儀［One Touch Ultra，強生(中國)醫(yī)療器材有限公司］、血糖試紙(lifescan公司，美國)、光學顯微鏡(尼康 E800，日本)、豚鼠抗人胰島素抗體(1∶2000，LINCO公司，美國)、山羊抗人 p22phox、gp91phox 抗體(1∶100，Santa Cruz生物技術公司，加拿大)、生物素化山羊抗豚鼠IgG抗體(1∶1000，Chemicon 公司，加拿大)、生物素化兔抗山羊IgS抗體(1∶200)與生物素化山羊抗小鼠IgS抗體(1∶200，Dako 公司，日本)。

1.4 檢測指標

1.4.1 相關生理指標檢測 每周監(jiān)測小鼠體重和隨機血糖，投藥前和投藥8周后測定空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FSI)、并計算葡萄糖和胰島素曲線下面積及胰島素敏感指數(shù)。并于投藥8周后，每組的5只小鼠均行腹腔葡萄糖耐量試驗(IPGTT)。用胰島素曲線下面積(AUCFSI)評價胰島分泌功能，以 0～30 min胰島素曲線下面積(AUCFSI0-30)評價早期相的胰島素分泌，計算公式為：AUCFSI0-30=FSI30-FSI0。

1.4.2 免疫組織化學測定 投藥8周后，取小鼠胰腺固定、包埋、切片后利用抗生物素蛋白-生物素復合物(ABC)法檢測胰島素、NADPH氧化酶p22phox亞基、gp91phox亞基的表達，按藥盒說明書操作。

1.4.3 胰島測量分析 光學顯微鏡下觀察切片并拍照，利用Axiovision 4.3軟件獲得數(shù)字照片后用Image-Pro Plus 5.0.1軟件分析，胰島中p22phox和gp91phox的表達強度分析參照操作說明書。胰島β細胞含量測定使用胰島素染色照片分析并用下述公式計算：胰島β細胞含量(mg)=胰島面積/胰腺面積×胰腺重量。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布的計量數(shù)據以均數(shù)±標準差()表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，實驗前后的資料比較用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 生理指標 投藥前，EGb761組和db/db組的體重、血糖無明顯差異(P＞0.05)；投藥8周后兩組體重仍無顯著差異，但EGb761組平均空腹血糖顯著低于db/db組(P＜0.05)，且胰島素敏感指數(shù)明顯升高(P＜0.05，表1)。而db/m組投藥前投藥后各項指標均與EGb761組和db/db組有顯著差異(P＜0.05)。

2.2 EGb761對糖耐量及胰腺分泌功能的影響 糖負荷前及負荷后60、120 min，EGb761組血糖較db/db組顯著降低，且AUCFSI顯著低于db/db組(P＜0.05，圖1)。糖負荷后30 min EGb761組血漿胰島素水平升高，且AUCFSI0-30顯著高于db/db組(P＜0.05，表2、圖2)，說明 EGb761對糖耐量的改善部分得益于胰島β細胞早期相功能的改善。db/m組各項指標與EGb761組和db/db組亦有顯著差異(P＜0.05)。

2.3 EGb761對胰島質量的影響 與db/m組相比，db/db組的胰腺內胰島素染色強度明顯降低，提示胰島質量的顯著下降，而EGb761組的胰島素染色強度、胰島β細胞含量均顯著高于db/db組，介于 db/m組和 db/db組之間(圖 3、4)，表明了EGb761有效減輕了胰腺損傷導致的胰島質量下降。

2.4 EGb761對胰腺內NADPH氧化酶表達的影響Gp91phox和 p22phox陽性區(qū)域出現(xiàn)在胰島細胞的細胞質，半定量分析顯示db/db組gp91phox和p22phox表達最強，EGb761治療顯著降低gp91phox和p22phox表達強度，并低至接近db/m組水平(P＜0.01，圖5～8)，反映胰島內氧化應激程度下降。

表1 投藥前及投藥8周后相關生理指標比較()

表1 投藥前及投藥8周后相關生理指標比較()

注：與db/db組比較，*P＜0.05

圖1 葡萄糖耐量試驗血糖曲線

表2 葡萄糖耐量試驗中血糖和胰島素曲線下面積()

表2 葡萄糖耐量試驗中血糖和胰島素曲線下面積()

注：與db/db組比較，*P＜0.05

圖2 葡萄糖耐量試驗胰島素釋放曲線

3 討論

圖3 胰腺胰島素染色(ABC×400)

圖4 胰島組織胰島β細胞含量

圖5 胰島組織p22phox染色顯示(ABC×400)

圖6 胰島組織p22phox半定量顯示

圖7 胰島組織gp91phox染色顯示(ABC×400)

圖8 胰島組織gp91phox半定量顯示

本研究所選取的15只小鼠是同窩出生的，根據實驗要求，在進入本實驗前其中的10只小鼠已被成功造模成糖尿病鼠(db/db小鼠)，另5只作為非糖尿病對照組(db/m組)也納入本次實驗中。在實驗開始前把10只db/db小鼠隨機分為兩組，一組給予藥物灌胃作為實驗組(EGb761組)，另一組給予安慰劑灌胃作為糖尿病對照組(db/db組)，5只非糖尿病小鼠給予安慰劑灌胃作為非糖尿病對照組(db/m組)。分組的理論基礎是觀察db/m組與db/db組、EGb761組與db/db組、EGb761組與db/m組之間的體重、隨機血糖、IPGTT、胰島素敏感性、胰腺內NADPH氧化酶等各項指標變化，由此分析評估筆者所預計的實驗結果以及EGb761可能的降糖機制。

Guzik等［4］研究發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶是血管生成活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)的主要酶體，ROS可使細胞膜脂質過氧化、蛋白質變性、生物酶失活、核酸破壞，增強氧化應激等作用，本課題組前期研究證實ROS的過度蓄積不僅可以直接損傷胰島β細胞，還可通過影響胰島素合成和分泌的信號轉導通路間接導致β細胞損傷凋亡，從而損害胰島的分泌功能［5-10］。Gp91phox和p22phox是NADPH氧化酶復合體的膜結合亞基，被認為是NADPH氧化酶最主要的功能亞基，本研究利用免疫組化證實了gp91phox和p22phox在胰島β細胞中的表達，db/db組的表達強度遠超過db/m組，而EGb761治療可顯著降低NADPH氧化酶的表達，證明EGb761通過其強大的抗氧化、清除自由基能力降低小鼠血糖，改善胰島素分泌功能和胰島素敏感性，機制可能是通過降低氧化應激的上游因子如NADPH氧化酶gp91phox、p22phox亞基的表達水平而改善胰腺微環(huán)境，減輕氧化應激損傷，保護胰島 β細胞。但EGb761改善糖尿病的具體機制尚未完全明確，仍需進一步加以研究。

銀杏葉作為藥物使用在中國已有很久的歷史，其提取物EGb761作為一種公認的強抗氧化劑，已被證實不僅具有清除氧自由基、抑制NO的產生等作用，還能舒張血管平滑肌、降低外周血流阻力、增加局部血流量、改善心腦等器官血液循環(huán)［11-12］。Zhou等［13］證實銀杏內酯可拮抗氧化損傷導致的細胞凋亡，并且可以在凋亡早期阻斷其進程。Smith等［14］發(fā)現(xiàn)EGb761能夠維持線粒體膜的完整性，減少線粒體細胞色素C的釋放，而細胞色素C正是形成凋亡小體的關鍵分子。

近年來，隨著研究的不斷深入，糖尿病的治療已經超越傳統(tǒng)的促進胰島素分泌以及減輕胰島素抵抗上，針對性的抗炎、抗氧化已經成為糖尿病治療的熱點，EGb761、大黃酸［15］、鬼針草提取物［16］等都是近年來國內學者研究降糖機制的對象，中西醫(yī)聯(lián)手，“降”、“調”結合，優(yōu)勢互補不失為一條提高全人類健康的新途徑。

［1］向志雄，黃 誠，彭新君，等.中藥治療糖尿病及其并發(fā)癥研究進展［J］.中西醫(yī)結合學報，2006，4(3)：321-325.

［2］Lim S，Yoon JW，Kang SM，et al.EGb761—a Ginkgo biloba extract，is effective against atherosclerosis in vitro，and in a rat model of type 2 diabetes［J］.PLoS One，2011，6(6)：20301.

［3］Vasseur M，Jean T，DeFeudis FV，et al.Effects of repeated treatments with an extract of Ginkgo biloba(EGb761)，bilobalide and ginkgolide B on the electrical activity of pancreatic beta cells of normal or alioxan diabetic mice：anex vivo study with intracellular microelectredes［J］.Gen Pharmacol，1994，25(1)：31-46.

［4］Guzik TJ，Sadowski J，Kapelak B，et al.Systemic regulation of vascular NAD(P)H oxidase activity and nox isoform expression in human arteries and veins［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004，24(9)：1614-1620.

［5］邵加慶.局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)在2型糖尿病中的作用［J］.醫(yī)學研究生學報.2011，24(5)：449-452.

［6］Shao J，Iwashita N，Ikeda F，et al.Beneficial effects of candesartan，an angiotensin II type 1 receptor blocker，on beta-cell function and morphology in db/db mice［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，344(4)：1224-1233.

［7］Lu B，Wu H，Gu P，et al.Improved glucose-stimulated insulin secretion by intra-islet inhibition of protein-tyrosine phosphatase 1B expression in rats fed a high-fat diet［J］.J Endocrinol Invest，2012，35(1)：63-70.

［8］邵加慶，顧 萍，杜 宏，等.建立離體胰島灌流系統(tǒng)用于評估胰島素第一相分泌功能［J］.中華醫(yī)學雜志，2010，90(2)：119-121.

［9］邵加慶，巖下乃夕，杜 宏，等.血管緊張素II受體阻斷劑治療對db/db糖尿病小鼠胰島的作用［J］.中華內科雜志，2007，46(4)：306-310.

［10］邵加慶，巖下乃夕，杜 宏，等.坎地沙坦對db/db糖尿病小鼠胰島功能和結構的保護［J］.中華內分泌代謝雜志，2007，23(2)110-116.

［11］Kubota Y，Tanaka N，Umegaki K，et al.Ginkgo biloba extract-induced reIaxattion of rat aortais associated with increase in endothelial intracellular calcium level［J］.Life Sci，2001，69(20)：2327-2336.

［12］Nishida S.Satoh H.Comparative vasodilating actions among terpenoids and flavonoids contained in Ginkgo biloba extract［J］.Clin Chim Acta，2004，339(1-2)：129-133.

［13］Zhou LJ，Zhu XZ.Reactive oxygen species-induced apoptosis in PC12 cells and protective effect of bilobalide［J］.J Pharmacol Exp Ther，2000，293(3)：982-988.

［14］Smith J，Burdick A，Golik P，et al.Antiapoptoic properties of Ginkgo biloba extract EGB761 in differentiated PC12 cells［J］.Cell Mol Biol，2002，48：699-707.

［15］杜 宏，邵加慶，顧 萍，等.早期大黃酸干預對db/db小鼠胰島功能的影響［J］.南方醫(yī)科大學學報，2011，(9)：1526-1529.

［16］黃敏珠，陳海生，劉建國，等.鬼針草提取物對糖尿病大鼠降糖活性的初步觀察［J］.東南國防醫(yī)藥，2010，12(2)：100-101.