黃筱萍，黃國(guó)昌，印培民

(江西省科學(xué)院微生物研究所，江西 南昌，330029)

乳酸是世界上三大有機(jī)酸之一，在化工、醫(yī)藥、食品加工等領(lǐng)域有著廣泛的用途。目前，工業(yè)化生產(chǎn)L-乳酸多發(fā)玉米、大米和木薯淀粉糖為原料。隨著糧食來(lái)源食物作物的淀粉糖價(jià)格不斷攀升，乳酸發(fā)酵工業(yè)的利潤(rùn)逐漸降低，因此開(kāi)發(fā)低成本發(fā)酵工藝，尤其是采用各種廉價(jià)非糧生物質(zhì)原料進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)是降低乳酸生產(chǎn)成本，促進(jìn)聚乳酸產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的重要技術(shù)趨勢(shì)。

目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)有關(guān)以紅薯為原料進(jìn)行L-乳酸發(fā)酵的報(bào)道，主要以細(xì)菌發(fā)酵菊芋、木質(zhì)纖維素、木薯原料的研究居多，但是L-乳酸光學(xué)純度不如以米根霉生產(chǎn)菌高［1-3］。我們通過(guò)引進(jìn)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的紅薯品種進(jìn)行栽培，篩選出高淀粉產(chǎn)量的紅薯品種，并以之為原料進(jìn)行了L-乳酸發(fā)酵的研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

米根霉Fp-6(Rhizopus oryzae Fp-6)，由江西省科院生物技術(shù)有限責(zé)任公司分離保存。

1.1.2 紅薯品種

①梅營(yíng)1 號(hào);②秦薯5 號(hào);③FL-19;④蘇薯303;⑤豫薯王;⑥徐薯22;⑦紅星431;⑧秦薯4 號(hào)。

1.1.3 培養(yǎng)基

(1)斜面培養(yǎng)基(%):馬鈴薯斜面(PDA)培養(yǎng)基，馬鈴薯200，蔗糖20，瓊脂20，水1 000 mL，pH自然。

(2)種子培養(yǎng)基(%):玉米淀粉5.0，葡萄糖5.0，(NH4)2SO40.135 ，無(wú)機(jī)鹽微量，CaCO31.0，115 ～120 ℃滅菌30 min。

(3)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(%):淀粉12，(NH4)2SO41.35，無(wú)機(jī)鹽 微量，消泡劑0.01 ～0.03，CaCO3在發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)加。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

(1)斜面菌種培養(yǎng):用少量無(wú)菌水(約5 ～10 mL)洗脫斜面孢子制成懸液，或直接挑取菌絲，接種于PDA 斜面上，于28℃培養(yǎng)10 ～14 d。

(2)一級(jí)種子液培養(yǎng):將斜面孢子洗脫液接入錐形瓶中，使培養(yǎng)基中孢子終濃度為1.0 ×106～2.0 ×106CFU/mL。于30℃，200 r/min 搖床培養(yǎng)12 ～16 h。

(3)二、三級(jí)種子液培養(yǎng):接種量5%，培養(yǎng)溫度，35 ℃，空氣流量0.1 ～0.25 vvm，轉(zhuǎn)速300 r/min，培養(yǎng)9 ～15 h。

(4)發(fā)酵:接種量5%，培養(yǎng)溫度35 ℃，通氣量:0.05 ～0.2 vvm，采用間斷添加25% ～30% 的無(wú)菌CaCO3溶液的方法控制pH 在5.5 ±0.5。

1.2.2 紅薯的預(yù)處理

(1)紅薯淀粉制備［4］:稱取紅薯100 kg，清洗，粉碎，用石磨研磨成漿，用2 ～3 倍體積的清水洗2 次，先后分別用20 目和100 目篩過(guò)濾，濾液靜置沉淀過(guò)夜，棄上清液，沉淀用清水清洗后靜置沉淀，棄上清液，沉淀置烘箱中烘干即為紅薯淀粉。

(2)去皮紅薯液化液的制備:紅薯蒸煮，去皮，磨碎，液化，濃縮備用。

(3)紅薯液化液的制備:紅薯蒸煮，磨碎，液化，濃縮備用。

(4)去有機(jī)N 紅薯液化液制備:紅薯洗凈稱重，加水粉碎，漿液靜置過(guò)夜，棄上清液，加水?dāng)噭蚝箪o置沉淀，棄上清液，液化，測(cè)定含糖量和總N 量，濃縮備用。

1.2.3 分析方法

(1)L-乳酸、富馬酸、甘油等含量分析:LC-10Avp型液相色譜儀(日本島津)，檢測(cè)器RID-10A 示差檢測(cè)器，色譜柱OAapak-A，柱溫40 ℃，流動(dòng)相0.75 mmol/L H2SO4，分析流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。

(2)L-乳酸光學(xué)純度分析:LC-10Avp 型液相色譜儀，檢測(cè)器SPD-10Avp 紫外檢測(cè)器，色譜柱SUMICHIRAL OA-5000(φ 4.6 mm×150 mm)，柱溫40 ℃，波長(zhǎng)254 nm，流動(dòng)相1 mmol/L CuSO4溶液，分析流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。

(3)殘?zhí)菧y(cè)定:發(fā)酵液于10 000 r/min 離心5 min，取上清液，采用DNS 顯色法測(cè)定糖濃度。

(4)淀粉含量測(cè)定［5］:參照GB/T5009.9 -2003。紅薯洗凈去皮后，切成細(xì)絲，稱取100 g 左右，并加入等量的水，用豆?jié){機(jī)打成勻漿，立刻稱取勻漿10 g，參照GB/T5009.9—2003 中酸水解法進(jìn)行檢測(cè)。

(5)水分測(cè)定［6］:參照GB/T 5009.3—2003。

(6)N 含量測(cè)定［7］:凱氏定氮法，參照GB/T 5009.5—1985。

2 結(jié)果與討論

2.1 高淀粉紅薯品種的篩選和組分分析

共種植了8 個(gè)品種的紅薯，產(chǎn)量和組分見(jiàn)表1。

表1 不同品種紅薯畝產(chǎn)量和淀粉產(chǎn)量Table 1 Acre yield and starch acre yield of sweet potato varieties

紅星431 淀粉量最高，其次是豫薯王、梅營(yíng)1 號(hào)、FL-19、秦薯5 號(hào)，其他低于20%，紅星431 淀粉含量和畝產(chǎn)淀粉量最高，但其含N 量也最高，雖然豫薯王淀粉含量比梅營(yíng)1 號(hào)稍高，但其畝產(chǎn)量低，畝產(chǎn)淀粉亦低于梅營(yíng)1 號(hào)，因此選用紅星431 和梅營(yíng)1 號(hào)作為發(fā)酵試驗(yàn)優(yōu)質(zhì)品種。

2.2 紅薯淀粉的制備

分別取紅星431 和梅營(yíng)1 號(hào)鮮薯各100 kg，制備發(fā)酵用粗紅薯淀粉原料，分別測(cè)定淀粉提取收率。

表2 鮮薯制備淀粉過(guò)程中各參數(shù)Table 2 Parameters in the process of starch preparation with fresh sweet potato

影響淀粉收率的原因可能有以下2 種:(1)紅薯的粉碎程度，顆粒粉碎的大小可能影響紅薯中的淀粉完全釋放出來(lái);(2)在濾渣的洗滌過(guò)程中，由于洗滌條件限制，淀粉可能不能完全洗至水中，部分淀粉被帶到廢渣中而影響最后的淀粉收率。改進(jìn)粉碎紅薯和洗滌設(shè)備可提高淀粉收率。

2.3 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)

2.3.1 不同預(yù)處理紅薯對(duì)L-乳酸產(chǎn)量的影響

以3 種不同預(yù)處理的紅薯為原料，折成淀粉量為120 g/L，分別液化后，配制發(fā)酵培養(yǎng)基，采用一級(jí)種發(fā)酵，接種量10%，200 r/min，35 ℃培養(yǎng)48 h，發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液定容至100 mL，分別測(cè)定光學(xué)純度、乳酸含量、殘?zhí)橇亢途w干重。

表3 不同預(yù)處理紅薯原料對(duì)L-乳酸產(chǎn)量的影響Table 3 The effect of sweet potato starch with different pre-preparation on L-Lactic acid yield

與對(duì)照玉米淀粉為原料的產(chǎn)酸水平相比，搖瓶發(fā)酵48 h，利用紅薯淀粉為原料發(fā)酵產(chǎn)酸水平、菌體干重和殘?zhí)菨舛染c玉米淀粉相同。而使用紅薯液化液發(fā)酵過(guò)程中，菌絲體量大大增加，為淀粉原料的4～6 倍，且菌絲體纏繞成大塊的團(tuán)狀，產(chǎn)酸水平大大下降，這可能是由于紅薯中含有較豐富的有機(jī)N 源，米根霉在富有機(jī)N 培養(yǎng)基中過(guò)度繁殖生長(zhǎng)，在搖瓶培養(yǎng)過(guò)程中菌絲體纏繞成大塊的團(tuán)狀，影響O2的傳質(zhì)，不利乳酸的生成。去皮紅薯液化液為原料的培養(yǎng)液中其菌體濃度最高，表明紅薯皮中可能含有可抑制菌體生長(zhǎng)的因子。雖然利用紅薯淀粉發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸產(chǎn)量與玉米淀粉相似，產(chǎn)量最高，但從發(fā)酵成本考慮，制備紅薯淀粉生產(chǎn)流程長(zhǎng)，且會(huì)造成一部分淀粉流失，同時(shí)有大量有機(jī)廢水排放，增加發(fā)酵原料成本和廢水處理運(yùn)行成本，因此以下試驗(yàn)均采用紅薯液化糖作為發(fā)酵原料。

2.3.2 紅薯中的有機(jī)氮濃度對(duì)米根霉菌絲體的生長(zhǎng)和產(chǎn)L-乳酸產(chǎn)量的影響

在玉米淀粉為原料的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同濃度的有機(jī)N 源，有機(jī)N 來(lái)源為制備紅薯淀粉(紅星431)時(shí)的上清廢液，試驗(yàn)Ⅰ組的有機(jī)N 的添加量分別為1.0，0.75，0.5，0.25 和0.125 g/L，不加無(wú)機(jī)N，試驗(yàn)Ⅱ組除添加有機(jī)N 源外，再按常量添加無(wú)機(jī)N，分別考察有機(jī)氮濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酸的影響，以及在不同有機(jī)N 濃度的條件下無(wú)機(jī)N 對(duì)米根霉發(fā)酵產(chǎn)酸的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。

2 組試驗(yàn)結(jié)果均表明，隨著紅薯中有機(jī)N 濃度的增加，菌體量明顯增加，為正常發(fā)酵菌量的2 ～6 倍。在未添加無(wú)機(jī)N 的條件下，發(fā)酵液中有機(jī)N 濃度低于0.5 g/L 時(shí)對(duì)產(chǎn)酸影響不大，但菌體量隨著有機(jī)N濃度的增加而明顯增加。當(dāng)發(fā)酵液中有機(jī)N 濃度高于0.5 g/L 時(shí)，菌體生長(zhǎng)過(guò)盛，嚴(yán)重影響產(chǎn)酸，產(chǎn)酸量明顯下降。在試驗(yàn)Ⅱ組的結(jié)果與試驗(yàn)Ⅰ組相似，但在相同的有機(jī)N 濃度條件下，添加無(wú)機(jī)N 能明顯促進(jìn)乳酸的生成，尤其是在有機(jī)N 濃度低于0.5 g/L 時(shí)，加入無(wú)機(jī)N 源對(duì)產(chǎn)酸影響更加顯著。因此在以紅薯液化糖為原料發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸時(shí)，控制發(fā)酵液中有機(jī)N 濃度在0.5 g/L 內(nèi)比較適宜。同時(shí)添加無(wú)機(jī)N 源有利于發(fā)酵產(chǎn)酸。

表4 有機(jī)N 和無(wú)機(jī)N 對(duì)米根霉發(fā)酵產(chǎn)酸的影響Table 4 The effects of organic N and inorganic N on L-Lactic acid fermenting by Rhizopus oryzea

2.3.3 C/N 比對(duì)L-乳酸發(fā)酵的影響

梅營(yíng)1 號(hào)紅薯液化糖濃度為120 g/L 時(shí)，液化糖液中有機(jī)N 含量為0.51 g/L。玉米淀粉中有機(jī)N含量為0.13 g/L，(NH4)2SO4的添加分為2 組，一組按正常的添加量全部添加，另一組根據(jù)原料配比中的有機(jī)N 量，添加一定量的無(wú)機(jī)N 量，保持C/N=90。搖瓶發(fā)酵48 h，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 C/N 比對(duì)L-乳酸發(fā)酵的影響Table 5 The effect of C/N on L-Lactic acid fermenting

1 ～2 號(hào)為對(duì)照組，3 ～7 號(hào)為添加常量的無(wú)機(jī)鹽的試驗(yàn)Ⅰ組，8 ～12 號(hào)為固定C/N 比為90 的試驗(yàn)Ⅱ組。試驗(yàn)Ⅰ組中隨著C 源配料中紅薯液化液添加量的增加，C/N 比從77 逐漸下降至54，菌體量和副產(chǎn)物甘油明顯增加，L-乳酸的產(chǎn)量逐漸減少，這進(jìn)一步驗(yàn)證紅薯液化糖中含有的有機(jī)氮會(huì)促使菌體生長(zhǎng)過(guò)盛，導(dǎo)致菌絲結(jié)團(tuán)，影響產(chǎn)酸速度和糖轉(zhuǎn)化率;當(dāng)控制C/N 比為90 時(shí)，與對(duì)照組和試驗(yàn)Ⅰ組相比，L-乳酸產(chǎn)量略偏低，且發(fā)酵液中副產(chǎn)物甘油和富馬酸含量明顯偏高，這表明無(wú)機(jī)N 對(duì)米根霉發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸具有促進(jìn)作用。結(jié)果表明，適宜的C/N 比為在添加1.35 g/L 的(NH4)2SO4條件下，C/N 比≥65%有利于L-乳酸的發(fā)酵產(chǎn)酸。

2.3.4 50 L 罐發(fā)酵放大試驗(yàn)

2.3.4.1 未去除有機(jī)N 的紅薯液化糖對(duì)發(fā)酵的影響

分別制備紅星431 和梅營(yíng)1 號(hào)紅薯液化糖，當(dāng)總糖濃度為120 g/L 時(shí)，紅星431 液化液和梅營(yíng)1 號(hào)液化液中有機(jī)N 濃度分別為1.11 和0.51 g/L。根據(jù)搖瓶試驗(yàn)結(jié)果，在50L 發(fā)酵罐中分別用玉米淀粉+紅星431 紅薯液化糖和梅營(yíng)1 號(hào)紅薯液化糖為原料，試驗(yàn)罐1 為玉米淀粉對(duì)照罐，罐2 為60 g/L 玉米淀粉+60 g/L 紅星431 紅薯液化糖，罐3 梅營(yíng)1 號(hào)120 g/L紅薯液化糖，(NH4)2SO4添加量均為1.35 g/L，三罐為平行試驗(yàn)，采用三級(jí)種發(fā)酵，比較發(fā)酵周期和糖轉(zhuǎn)化率。發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)表6，發(fā)酵液中乳酸和殘?zhí)亲兓?jiàn)圖1。

表6 50 L 罐發(fā)酵結(jié)果Table 6 The results of fermentation in 50 L fermentor

圖1 發(fā)酵過(guò)程中L-乳酸和殘?zhí)亲兓疐ig.1 Transformations of L-lactic acid and residual sugar in the process of fermentation

由于紅薯漿液化糖中有機(jī)氮含量較高，在發(fā)酵前期，尤其是在發(fā)酵10 ～18 h，在攪拌和通氣條件下，發(fā)酵液大量起泡，必須流加消泡劑進(jìn)行消泡，同時(shí)要降低攪拌速度和空氣流量，攪拌速度從200 r/min 降至120 r/min ，通氣量亦根據(jù)發(fā)泡的情況適時(shí)調(diào)節(jié)，溶氧比對(duì)照罐1 低20% ～40%，由于溶氧下降，副產(chǎn)物富馬酸和甘油濃度明顯高于1 號(hào)罐。發(fā)酵趨勢(shì)亦表明在發(fā)酵前期，以玉米淀粉為原料的罐1 產(chǎn)酸明顯較紅薯液化糖高，試驗(yàn)罐2 和罐3 發(fā)酵周期延長(zhǎng)了6 ～8 h，終糖轉(zhuǎn)化率亦比以玉米淀粉低。可能是由于前期為控制發(fā)酵液起泡，改變發(fā)酵控制條件而造成產(chǎn)酸延遲和發(fā)酵周期延長(zhǎng)。菌體量比對(duì)照玉米淀粉為原料的罐1 高50%左右，這也是造成糖轉(zhuǎn)化率偏低的主要原因。

2.3.4.2 去除部分有機(jī)N 的紅薯液化糖對(duì)發(fā)酵的影響

由于紅薯液化糖中含有機(jī)N 高，在發(fā)酵罐發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的泡沫，同時(shí)菌體量明顯增加，從而造成發(fā)酵過(guò)程控制難度，增大染菌機(jī)率，使產(chǎn)酸量下降，發(fā)酵周期延長(zhǎng)，因此對(duì)紅薯糖化糖的制作進(jìn)行了改進(jìn)，即紅薯洗凈稱重后，加水粉碎，漿液靜置過(guò)夜，棄上清液，再加水，攪勻后靜置沉淀，棄上清，這樣可去除紅薯中絕大部分有機(jī)N，沉淀加淀粉酶液化，測(cè)定含糖量和總N 量。

試驗(yàn)罐1 為玉米淀粉對(duì)照罐，罐2 為120 g/L 改進(jìn)制作的紅星431 紅薯液化糖，其有機(jī)N 濃度為0.068 g/L，罐3 為120 g/L 改進(jìn)制作的梅營(yíng)1 號(hào)紅薯液化糖，其有機(jī)N 濃度為0.03 g/L，(NH4)2SO4添加量均為1.35 g/L，三罐為平行試驗(yàn)，采用三級(jí)種發(fā)酵，比較發(fā)酵周期和糖轉(zhuǎn)化率。發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)表7，發(fā)酵液中乳酸和殘?zhí)亲兓?jiàn)圖2。

經(jīng)過(guò)去除有機(jī)N 的紅薯液化糖，在發(fā)酵過(guò)程中未發(fā)生大量起泡的現(xiàn)象，其發(fā)酵周期和糖轉(zhuǎn)化率均與以玉米淀粉為原料基本相同，乳酸產(chǎn)生和糖消耗速率無(wú)明顯差異，發(fā)酵副產(chǎn)物富馬酸和甘油濃度亦無(wú)明顯增加，發(fā)酵周期48 h，糖轉(zhuǎn)化率均≥80.0%，光學(xué)純度均為100%?？梢匀〈衩椎矸圩鳛榘l(fā)酵原料。

表7 50 L 罐發(fā)酵結(jié)果Table 7 The results of fermentation in 50 L fermentor

圖2 發(fā)酵過(guò)程中L-乳酸和殘?zhí)亲兓疐ig.2 Transformations of L-lactic acid and residual sugar in the process of fermentation

3 結(jié)論

采用2 個(gè)高淀粉紅薯品種為原料，米根霉發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，紅薯液化糖中的有機(jī)N 濃度對(duì)發(fā)酵影響顯著。在搖瓶發(fā)酵過(guò)程中表現(xiàn)為菌體量明顯增加，菌體量隨著有機(jī)N 濃度的增加而明顯增加，菌體量為淀粉原料的菌量的2 ～6 倍，且副產(chǎn)物富馬酸和甘油濃度亦呈增加趨勢(shì)。在50 L 罐發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵前期會(huì)大量發(fā)泡，需流加消泡劑和控制攪拌速度和空氣流量進(jìn)行消泡，這樣導(dǎo)致發(fā)酵前期產(chǎn)酸較低，發(fā)酵周期延長(zhǎng)，富馬酸和甘油濃度亦有所增加，使乳酸產(chǎn)量和糖轉(zhuǎn)化率比淀粉糖略低。采用去除大部分有機(jī)N的紅薯液化糖進(jìn)行50L 罐發(fā)酵，其糖轉(zhuǎn)化率≥80%，發(fā)酵周期為48 h，與淀粉類糖相同，完全可替代玉米淀粉作為原料生產(chǎn)L-乳酸。

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