張春紅，高爽，王六強，李晨

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽，110161)

近年來，隨著環(huán)境問題日益受到重視，人們使用可降解和可再生資源保護環(huán)境的意識不斷提高［1］。對一些動物蛋白和植物蛋白的研究證明了天然蛋白作為可食性包裝材料的可行性，其中花生蛋白因為來源廣泛，營養(yǎng)豐富，功能性顯著，分子中存在著大量的氫鍵、疏水鍵、范德華力、離子鍵、配位鍵等作用，成為制備可食性膜的良好材料［2-3］。但與合成膜相比，花生蛋白膜的機械性能、水溶性和阻水性等還不能滿足工業(yè)生產(chǎn)和實際應(yīng)用對包裝材料的要求，使其應(yīng)用受到限制。目前的研究表明，對花生蛋白進行改性能夠在一定程度上提高花生蛋白膜的性能，同常規(guī)的物理法和化學(xué)法改性方法相比，酶法改性具有可控性和安全性高，有效提高蛋白膜的機械強度和阻隔性能的特點［4］。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(TGase)是一種酰基轉(zhuǎn)移酶，可以催化蛋白質(zhì)中的谷氨?；唾嚢彼嵩诜肿觾?nèi)及分子間形成ε-(γ-谷氨酰基)–賴氨酸共價交聯(lián)［5］。研究表明，TGase 可以提高大豆蛋白、小麥蛋白、明膠、酪蛋白的成膜性以及膜的機械性能和阻隔性能［6-7］。但利用TGase 對花生蛋白進行改性的研究報道并不多見，本文擬利用谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶對花生蛋白進行改性，以改善PPI 膜的性能，為花生蛋白膜的進一步研究和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

谷氨酰轉(zhuǎn)移酶，泰興市東圣食品科技有限公司;低變性花生粕，山東高唐藍(lán)山集團公司;甘油，國藥試劑公司;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司;電子拉力試驗機，廣州標(biāo)際包裝設(shè)備有限公司;FTIR200 傅里葉變紅外光譜分析儀，Thermo Nicolet 公司;DSC-Q10 型差示掃描量熱儀，美國TA 儀器公司;DHG-9246A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗儀器設(shè)備有限公司;DNP-9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花生分離蛋白的制備

花生分離蛋白(PPI)參照Narendra Reddy［2］等堿溶酸沉方法制備。

1.3.2 花生蛋白膜的制備

根據(jù)單因素和響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果，將制備好的PPI 配制8%(w/v)的花生蛋白溶液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%(蛋白)的甘油，用1 mol/L NaOH 將溶液pH值調(diào)到9.5，在80℃下恒溫振蕩40 min，待溶液冷卻至40℃加入5U/g PPI 的TGase，并在40℃下反應(yīng)60 min。將蛋白液涂布于自制的玻璃板上，在恒溫干燥箱中65℃干燥3 h。在25℃，RH 50%環(huán)境中回軟后揭膜，即為改性PPI 膜，以不添加TGase 的PPI 膜作為對照。將膜在RH 50%下平衡48 h，待測。

1.3.3 膜性能指標(biāo)的測定

(1)厚度的測定

用螺旋測微器在制好的膜上隨機取5 個點，測量厚度，計算其平均值作為膜的厚度。

(2)機械性能的測定

參照GB13022 -1991 的方法，將樣品膜用專用磨具裁成100 mm ×15 mm 的小條，將樣品條兩端分別固定在電子拉力試驗機的樣品夾上，設(shè)定標(biāo)距為50 mm，試驗速度為250 mm/min，對膜的拉伸強度(Ts)及斷裂伸長率(Eb)進行測定。

(3)水溶性的測定

膜的水溶性采用姜燕等的方法進行測定。將樣品膜在105℃下烘干至恒重，放入盛有30 mL 蒸餾水的燒杯中，室溫下溶解24 h，將膜再次烘干至恒重，根據(jù)2 次重量差計算膜的水溶性［8］。

(4)水蒸氣透過率(WVP)的測定

按照GB 1037 -1988 塑料薄膜和片材透水蒸汽性試驗方法(杯式法)測定。

(5)紅外光譜分析

分別取適量的樣品膜，在恒溫干燥箱中烘干至恒重，分別取適量烘干的樣品膜與溴化鉀在研缽中混合研磨成粉末，在壓片機上壓成薄片，并在FT-IR200 傅里葉變紅外光譜分析儀中進行全波段(4 000 -500 cm-1)掃描，得到膜紅外譜圖［9］。

(6)阻氧性的測定

在容量為250 mL 的容器中，裝入20.0 g 新鮮大豆油，分別將對照及改性后的膜材覆蓋容器瓶口并密封，然后貯存在60℃培養(yǎng)箱里陳化12 d，測定花生油的過氧化值(POV)，以花生油的過氧化值衡量膜的阻氧性［10］?；ㄉ偷倪^氧化值采用GB/T 5538 -2005 中的方法進行測定。

(7)差示掃描量熱掃描(DSC)

采用差示掃描量熱儀對樣品膜的熱特性進行測定。稱取烘干燥至恒重的試樣3 ～5 mg，密封于鋁制樣品盤中，設(shè)定升溫速率為10℃/min，掃描溫度范圍為25 ～300℃。以空白樣品盤作為對照。

(8)掃描電鏡(SEM)觀察

將樣品干燥后淬斷，取5 mm×3 mm 左右樣品固定在樣品臺上噴金，在掃描電鏡下觀察膜斷面的微觀結(jié)構(gòu)，并拍照。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

本試驗中的數(shù)據(jù)通過獨立的3 次重復(fù)試驗得出平均值，并使用SPSS 軟件進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 膜性能

表1 為TGase 改性對PPI 膜性能的影響，由表1可知，與對照膜(TGase-膜)相比，改性膜(TGase +膜)的Ts提高了91.69%;Eb提高了53.69%;水溶性降低了15.12%;WVP 降低了32.85%;阻氧性提高了4.97%。分析原因認(rèn)為是由于TGase 催化PPI 分子使其發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，在分子內(nèi)及分子間形成了酰胺鍵，分子間作用力的增強，使膜的拉伸強度和斷裂伸長率都得到了較大程度的提高，同時膜的水溶性降低。交聯(lián)反應(yīng)也使膜結(jié)構(gòu)更加致密，從而膜的阻隔性能亦得到提高。

表1 TGase 改性對PPI 膜性能的影響Table 1 Properties of PPI films in the presence or absence of TGase

2.2 紅外光譜分析

傅立葉紅外光譜(F-TIR)是一種目前最為常用的分析多肽和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的方法，它能靈敏地反映出肽鏈結(jié)構(gòu)的變化。一般，蛋白質(zhì)的IR 光譜圖譜有幾組特征吸收譜帶，酰胺I，酰胺II 和酰胺III，其波長分別對應(yīng)于1 700 ～1 600 cm-1，1 530 ～1 550 cm-1和1260 ～1300 cm-1范圍，其中酰胺I 歸屬于C ═O伸縮振動，酰胺II 屬NH 變形振動或CN 伸縮振動［11］。

圖1 為PPI 膜的。由圖1 可以看出，與TGase-膜分別在3404.43 cm-1和3422.31 cm-1處有較強的吸收峰，應(yīng)屬于羥基和胺基的吸收峰;在2935.60 cm-1和2935.05 cm-1處有吸收峰，應(yīng)為CH3和CH2吸收峰;在1639.41 cm-1和1648.01 cm-1(酰胺I 區(qū)域)有吸收峰;1526.38 cm-1和1542.38 cm-1附近(酰胺II 區(qū)域)有吸收峰。通過對比可已看出，TGase+膜紅外光譜中的羥基和胺基酰胺I 以及酰胺II 的特征峰發(fā)生了明顯的藍(lán)移，其他特征峰則沒有明顯的改變，說明TGase 主要作用于蛋白的羥基及胺基基團［9］，結(jié)合已知的TGase 作用機理可以證明了TGase 改性使PPI 分子發(fā)生交聯(lián)，形成了酰胺鍵，從而提高了膜的機械性能。

圖1 PPI 膜紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectra of PPI films

2.3 DSC

蛋白質(zhì)的差示掃描熱量法是一種通過加熱蛋白質(zhì)，破壞其二級、三級、四級結(jié)構(gòu)，測量變性過程中的能量變化情況來反映蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征的分析方法［12］。圖2 為TGase-膜DSC 曲線，圖3 為TGase +膜DSC 曲線。

圖2 TGase-膜DSC 曲線Fig.2 DSC curve of TGase-film

圖3 TGase+膜DSC 曲線Fig.3 DSC curve of TGase+ film

由圖2 可知，TGase-膜從99.29℃開始吸熱熔融，至134.31℃完全融化，其熱焓值(△H)為90.37 J/g;由圖3 可知，TGase +膜從89.74℃開始吸熱熔融，至132.51℃完全融化，其熱焓值(△H)為26.56 J/g。實驗結(jié)果表明，經(jīng)TGase 改性后，PPI 膜峰寬變大，熱焓值下降。這是由于熱焓值的變化與氫鍵即蛋白中二級結(jié)構(gòu)的有序性有關(guān)，而峰寬則反映了蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)的差異［13］。TGase 改性使蛋白分子的氫鍵被嚴(yán)重破壞，改變了分子結(jié)構(gòu)，使蛋白分子的構(gòu)相變?yōu)榻庑臓顟B(tài)，直接導(dǎo)致蛋白分子內(nèi)α –螺旋含量的減少［14］而使膜的峰寬變大，熱焓值下降。

2.4 掃描電鏡

圖4 為對照膜斷面掃描電鏡圖片，圖5 為改性膜斷面掃描電鏡圖片。由圖4 和圖5 可以看出，與對照膜相比，經(jīng)TGase 改性后PPI 膜內(nèi)部孔洞變小，結(jié)構(gòu)更加致密。這是由于TGase 使蛋白發(fā)生交聯(lián)，蛋白結(jié)構(gòu)更加緊密。同時解釋了TGase + 膜的阻氧性和WVP 提高的原因。

圖4 對照膜掃描電鏡圖片F(xiàn)ig.4 SEM image of TGase-film

圖5 TGase 改性膜掃描電鏡圖片F(xiàn)ig.5 SEM image of TGase+ film

3 結(jié)論

與對照膜相比，經(jīng)TGase 改性后PPI 膜的拉伸強度、斷裂伸長率和阻氧性分別提高了91.69%、53.69%和4.97%;水溶性和水蒸氣透過率分別降低了15.12%和了32.85%。紅外光譜圖譜分析表明，TGase 主要作用于花生蛋白分子中的羥基及胺基，結(jié)合TGase 的作用機理證明TGase 改性使PPI 分子發(fā)生交聯(lián)，形成了酰胺鍵。DSC 圖譜分析表明，經(jīng)TGase 改性后PPI 膜的熱焓值下降，峰寬變大，說明了TGase 在使蛋白質(zhì)分子交聯(lián)的同時改變了花生蛋白原有的二級結(jié)構(gòu)。掃描電鏡圖片分析表明，經(jīng)TGase 改性后PPI 膜的內(nèi)部孔洞變小，結(jié)構(gòu)更加致密。

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