張志斌，吳小芳，楊慧林，，顏日明，曾慶桂，汪涯，朱篤，

1(江西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 江西省亞熱帶植物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌，330022)2(江西科技師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 江西省生物加工過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌，330013)3(國(guó)家單糖化學(xué)合成工程技術(shù)研究中心，江西 南昌，330027)

S-4-氯-3-羥基丁 酸酯(S-4-chloro-3-hydroxybutanoate esters，S-CHBE)是合成Slagenins B 和C 以及他汀類藥物—羥甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)還原酶抑制劑等的關(guān)鍵手性中間體，具有重要的應(yīng)用價(jià)值［1-2］。由于4-氯乙酰乙酸乙酯(ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate，COBE)易于合成且價(jià)格低廉，因此SCHBE 往往以COBE 為底物通過(guò)化學(xué)或生物催化不對(duì)稱合成制備。與化學(xué)催化不對(duì)稱合成相比，利用羰基還原酶不對(duì)稱合成S-CHBE 具有效率高、選擇性強(qiáng)、成本低、裝置簡(jiǎn)單、環(huán)境污染少等顯著優(yōu)勢(shì)，受到了人們的廣泛關(guān)注［3-5］。目前，采用篩選到的微生物開(kāi)展全細(xì)胞催化合成單一構(gòu)型的CHBE，存在微生物細(xì)胞中氧化還原酶類組成復(fù)雜、催化活性不高、產(chǎn)物CHBE 對(duì)映體過(guò)量值(e. e. )偏低等問(wèn)題［1，4］;而采用還原酶在添加輔酶的情況下還原COBE 為單一構(gòu)型的CHBE，存在輔酶價(jià)格昂貴、高純度還原酶難以獲得等難題［5］。因此，利用基因工程手段構(gòu)建羰基還原酶基因工程菌，共表達(dá)葡萄糖脫氫酶等基因或偶聯(lián)葡萄糖脫氫酶基因工程菌等提供還原力，可能成為實(shí)現(xiàn)高效、高選擇性合成單一構(gòu)型CHBE 的有效途徑。

S1 羰基還原酶(S1-KRED)是從Candida magnoliae AKU4643 分離獲得的，屬短鏈醇脫氫酶家族，具有高催化活性和高立體選擇性［6-7］。Yasohara 等從Candida magnoliae 中獲得S1 羰基還原酶基因，用不同的宿主和載體構(gòu)建羰基還原酶基因工程菌獲得高比酶活羰基還原酶，偶聯(lián)葡萄糖脫氫酶基因工程菌而實(shí)現(xiàn)不對(duì)稱還原COBE 制備S-CHBE，對(duì)映體過(guò)量值(e. e. )接近100%［8］;葉齊等設(shè)計(jì)引物從Pichia stipitis 中獲得羰基還原酶基因(PsCR 及PsCR II)，通過(guò)優(yōu)化SD 序列而獲得高酶活的重組工程菌，然后構(gòu)建共表達(dá)載體來(lái)實(shí)現(xiàn)不對(duì)稱還原COBE 制備S-CHBE，產(chǎn)物的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)91%，對(duì)映體過(guò)量值(e. e. )超過(guò)99%［9-10］。影響外源基因表達(dá)水平的因素很多，除了表達(dá)系統(tǒng)及旁側(cè)的調(diào)控元件外，基因自身的編碼序列中也含有與該基因表達(dá)水平有關(guān)的關(guān)鍵信息，密碼子的選擇就是影響表達(dá)的參數(shù)之一，但目前對(duì)該基因密碼子進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化、分析比較研究在國(guó)內(nèi)未見(jiàn)正式報(bào)道。為進(jìn)一步提高該酶在大腸桿菌中的表達(dá)效率，以實(shí)現(xiàn)S-CHBE 的高效制備，本研究利用JCat軟件對(duì)S1 酮基還原酶基因序列進(jìn)行E. coli 密碼子偏嗜性優(yōu)化，獲得新的S1＇基因序列(Genbank accession No. KC426948)，并利用該序列構(gòu)建重組菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-S1＇，在此基礎(chǔ)上對(duì)其誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)重組菌E. coli BL21(DE3)/pET28a-S1＇不對(duì)稱還原COBE 制備S-CHBE 的能力進(jìn)行了考察。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

表達(dá)載體pET28a (+ )、宿主E. coli BL21(DE3)，均由作者實(shí)驗(yàn)室保存，葡萄糖脫氫酶(GDH)重組菌E. coli BL21(DE3)/pET28a -gdh 由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，GDH 擴(kuò)增自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，采用Strecker HJ 的方法測(cè)定E. coli BL21(DE3)/pET28a-gdh 經(jīng)誘導(dǎo)后的GDH 活力，酶活力為8.96 U/mg 蛋白［11］。

1.2 主要試劑和工具酶

限制性內(nèi)切酶Nco I、Bam HI、T4-DNA 連接酶等，購(gòu)自寶生物(大連)生物工程有限公司(TaKa-Ra);DNA 回收試劑盒(Gel Extraction Kit)、SDSPAGE 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，購(gòu)自上海生物工程公司;異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司;4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)和S-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(S-CHBE)，購(gòu)自阿達(dá)瑪斯(Adamas)有限公司;其余試劑和藥品均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 羰基還原酶基因序列的人工合成

根 據(jù) Yasohara［8］等 人 報(bào) 道 的 C. magnoliae AKU4643 的S1 羰基還原酶氨基酸序列，利用JCat 軟件進(jìn)行E. coli 密碼子偏嗜性優(yōu)化設(shè)計(jì)獲得的基因序列S1＇(Genbank accession No. KC426948)，將S1 和S1＇基因序列均送到上海生工有限公司進(jìn)行合成，N、C 端分別添加Nco I 酶切位點(diǎn)與Bam HI 酶切位點(diǎn)。

1.4 大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將上海生工公司全基因合成的S1 和S1＇ 基因通過(guò)Nco I/Bam HI 雙酶切，克隆到表達(dá)載體pET28a(+)相應(yīng)的酶切位點(diǎn)上，分別得到表達(dá)載體pET28a-S1 和pET28a-S1＇，然后轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主E. coli BL21(DE3)中，分別得到基因工程菌BL21 (DE3)/pET28a-S1 和BL21(DE3)/pET28a-S1＇。質(zhì)粒DNA的分離純化、感受態(tài)細(xì)胞的制備等參照文獻(xiàn)［12］及試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.5 KRED 酶活力的測(cè)定

(1)重組細(xì)胞粗酶液的制備。重組菌接種至含100 μg/mL 卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)過(guò)夜后，以2%接種量接種至新鮮LB 培養(yǎng)基中(含100 μg/mL 卡那霉素)，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)至OD600nm為0.6 ～0.8 時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG(終濃度為1 mmol/L)，誘導(dǎo)6 h 后測(cè)定KRED 活力。取經(jīng)誘導(dǎo)的菌液離心(4℃，4 000 r/min，10 min)，菌泥用0.1 mol/L 磷酸鉀緩沖(pH6.5)重懸，超聲破碎細(xì)胞(功率300 W，超聲5 s，間歇5 s，共5 min)，離心(4 ℃，12 000 r/min，10 min)，上清液用于KRED 酶活測(cè)定。

(2)NADPH 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。配制不同濃度(0 ～1 mmol/L)的NADPH 標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在340 nm 處測(cè)定吸光值，建立NADPH 濃度(Y，mmol/L)與吸光度(X)間回歸方程:Y = 0.478 7X - 0.004 2(R =0.997 7)。

(3)KRED 酶活測(cè)定。測(cè)定體系包括0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH7.0)、0.1 mmol/L NADPH、5 mmol/L 的COBE 和適量粗酶液。加入酶液后立即開(kāi)始掃描反應(yīng)體系在340 nm 處吸光度的下降，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算反應(yīng)消耗NADPH 的量。酶活單位定義:每分鐘消耗1 μmol NADPH 所需要的酶量［13］。同時(shí)，采用Bradford 方法測(cè)定該無(wú)細(xì)胞粗酶液中蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白BSA 為標(biāo)準(zhǔn)品［14］。

1.6 目的蛋白SDS-PAGE 檢測(cè)

采用5%的濃縮膠、15%的分離膠進(jìn)行電泳，電泳后凝膠用考馬斯亮藍(lán)R250 染色，誘導(dǎo)后的空宿主菌株作陰性對(duì)照［14］。

1.7 工程菌轉(zhuǎn)化活力的檢測(cè)

分別取誘導(dǎo)后BL21(DE3)/pET28a-S1＇和E.coli BL21(DE3)/pET28a-gdh 細(xì)胞濕重各0.2 g，懸浮于10 mL 5%葡萄糖的磷酸緩沖溶液(0.1 mol/L，pH 7.0)，裝入50 mL 具塞三角瓶中，25℃、150 r/min條件下振搖10 min，加入初始濃度為22.4 g/L 的底物COBE，繼續(xù)振搖反應(yīng)，轉(zhuǎn)化過(guò)程中0.1 mol/L NaHCO3維持pH7.0。每隔1 h 定時(shí)取樣，離心(4 000 r/min，10 min)沉淀菌體，取上清液反應(yīng)液用等體積的乙酸乙酯萃取2 次，合并萃取液，減壓蒸干溶劑得到樣品，分析底物、產(chǎn)物含量及產(chǎn)物對(duì)映體過(guò)量值(e. e. )，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.8 產(chǎn)物得率及光學(xué)純度分析

COBE 和CHBE 濃度測(cè)定采用氣相色譜法，分析條件為:島津GC-2010，OV-1 色譜柱(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm)，載氣為氮?dú)?，進(jìn)樣量0.2 μL，氣化溫度250℃，檢測(cè)器溫度280 ℃，梯度升溫(初始柱溫80 ℃，保持3 min;以15℃/min 梯度升溫至200 ℃，保持10 min);氫離子火焰檢測(cè)器。COBE 和CHBE的出峰時(shí)間分別為6.9 min 和7.5 min。產(chǎn)物對(duì)映體過(guò)量值(e. e. )的測(cè)定采用HPLC 法，分析條件為:CHIRALCEL? OD-H 手性色譜柱(4.6 mm × 250 mm;Daicel Chemical Industries，Japan)，室溫，流動(dòng)相為V(正己烷)∶V(異丙醇)=95∶5，流速0.8 mL/min，λ=220 nm，S-CHBE、R-CHBE 保留時(shí)間分別為10.5 min、18.5 min。e. e. 的計(jì)算公式為:

其中R，S 分別為對(duì)映體的濃度。

2 結(jié)果

2.1 羥基還原酶基因密碼子優(yōu)化及表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)C. magnoliae AKU4643 的S1 -KRED 氨基酸序列，利用軟件JCat 進(jìn)行E. coli 密碼子偏嗜性優(yōu)化設(shè)計(jì)后獲得的S1＇基因序列。JCat 是一款專門用于密碼子優(yōu)化設(shè)計(jì)的軟件，該軟件綜合考慮某物種最優(yōu)密碼子以及mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)等因素進(jìn)行基因的密碼子優(yōu)化。在不改變氨基酸序列的情況下，我們選擇了E. coli k12 菌株的最優(yōu)密碼子表進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化前和優(yōu)化后的序列差異見(jiàn)圖1。

圖1 羥基還原酶基因密碼子優(yōu)化序列圖Fig.1 Carbonyl reductase gene codon optimization sequence

根據(jù)1.4 的方法構(gòu)建的羰基還原酶重組質(zhì)粒pET28a-S1 和pET28a-S1＇(圖2)，轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞E.coli BL21(DE3)中，分別獲得重組菌E. coli BL21(DE3)/pET28a-S1 和E. coli BL21(DE3)/pET28a-S1＇。陽(yáng)性克隆中提取質(zhì)粒分別用Nco I 和Bam HI 進(jìn)行雙酶切鑒定，產(chǎn)物為850 bp 左右一條帶(圖3)，這與插入的外源基因KRED 大小一致，表明外源基因已成功插入到載體pET28a(+)中。酶切陽(yáng)性的質(zhì)粒送上海生工公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，KRED 基因開(kāi)放讀碼框(ORF)長(zhǎng)度為852bp，將該ORF 在Genebank nucleic-nucleic Blast 中進(jìn)行檢索，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與S1’基因有很高同源性的序列，其與S1 基因序列同源性僅為68%。S1＇與S1 基因編碼蛋白氨基酸序列相同，含283 個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為30.4 kDa，均與C. magnoliae AKU4643 中報(bào)道的羥基還原酶S1 氨基酸序列一致。

圖2 重組質(zhì)粒示意圖Fig.2 Recombinant plasmid

圖3 重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切電泳分析Fig.3 Restrict enzyme digestion analysis of recombinant plasmid

2.2 KRED 基因的誘導(dǎo)表達(dá)

采用1.5 方法對(duì)重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDSPAGE 電泳分析表明，誘導(dǎo)后的重組菌在30 kDa 左右有明顯的蛋白條帶，與目的蛋白分子質(zhì)量相符，而陰性對(duì)照菌在相應(yīng)位置無(wú)蛋白條帶(圖4)。酶活力分析表明，BL21(DE3)/pET28a-S1＇的KRED 酶活達(dá)9.28 U/mg 蛋 白，為 BL21 (DE3)/pET28a-S1 的KRED 酶活(7.97 U/mg 蛋白)的1.16 倍。這表明，KRED 在E. coli BL21 中獲得較好表達(dá)，且經(jīng)E. coli密碼子偏嗜性優(yōu)化獲得S1＇基因在E. coli 中表達(dá)效果更好。

圖4 SDS-PAGE 檢測(cè)重組蛋白表達(dá)Fig.4 SDS-PAGE analysis of cell-free extracts from recombinant E.coli

2.3 誘導(dǎo)條件優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)基的選擇

將重組菌BL21(DE3)/pET28a-S1＇分別接種于LB、MBL 和2 × YT 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)(圖5)。結(jié)果表明，在3 種培養(yǎng)基中E. coli BL21(DE3)/pET-S1＇均能較好生長(zhǎng)，其在2 ×YT 培養(yǎng)基中菌體量達(dá)到最高，而在LB 培養(yǎng)基中酶活力最高(9.39 U/mg 蛋白)，因此選擇LB 作為重組菌BL21(DE3)/pET28a-S1＇的培養(yǎng)基。

2.3.2 IPTG 誘導(dǎo)濃度優(yōu)化

按1.5 接種方法，研究了不同終濃度IPTG 誘導(dǎo)對(duì)工程菌表達(dá)KRED 酶活的影響。結(jié)果表明，0.8 mmol/L濃度IPTG 誘導(dǎo)時(shí)的酶活最高(9.47 U/mg 蛋白)，過(guò)低或過(guò)高的誘導(dǎo)劑濃度都不適合對(duì)酶進(jìn)行誘導(dǎo)(圖6A)。

圖5 培養(yǎng)基對(duì)重組菌生長(zhǎng)和酶活的影響Fig.5 Effect of mediums on growth and enzyme activity of the recombinant strain

2.3.3 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化

按1.5 接種方法，研究了20、25、30、37 和40℃等不同誘導(dǎo)溫度對(duì)工程菌表達(dá)KRED 的影響。結(jié)果表明，30℃下誘導(dǎo)KRED 的酶活最高(10.28 U/mg 蛋白)(圖6B)。這可能是因?yàn)榻档蜏囟日T導(dǎo)可以降低蛋白質(zhì)合成速率，使蛋白質(zhì)正確折疊以減少包涵體的產(chǎn)生，增加了目的蛋白質(zhì)的可溶性。

2.3.4 誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化

按1.5 方法接種和培養(yǎng)，加入0.8 mmol/L 的IPTG 分別誘導(dǎo)2、4、6、8、10、12 h。結(jié)果表明，加入IPTG 誘導(dǎo)8 h 時(shí)酶活達(dá)到最高(11.49 U/mg 蛋白)，8 h 后酶活開(kāi)始下降(圖6C)，下降原因可能是誘導(dǎo)后期由于蛋白質(zhì)聚集形成包涵體或者細(xì)胞內(nèi)蛋白酶降解重組蛋白質(zhì)等導(dǎo)致了酶活的下降。

圖6 工程菌誘導(dǎo)條件優(yōu)化Fig.6 Induction optimization of the recombinant strain

2.4 雙重組菌全細(xì)胞還原制備S-CHBE

以4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)作為底物，利用工程菌在細(xì)胞水平上進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，以此來(lái)檢測(cè)工程菌轉(zhuǎn)化活性。色譜分析結(jié)果顯示，在未添加NAD(P)H等輔酶的條件下，BL21(DE3)/pET28a-S1＇耦合E.coli BL21(DE3)/pET28a-gdh 可高效催化COBE 生成S-CHBE，而陰性對(duì)照的大腸桿菌未顯示轉(zhuǎn)化活性。雙重組菌耦合轉(zhuǎn)化10 h，產(chǎn)物摩爾得率達(dá)92.1%，底物COBE 基本轉(zhuǎn)化完全，反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)物的對(duì)映體過(guò)量值(e. e. )始終保持100%(圖7)。這表明我們?cè)O(shè)計(jì)并克隆的重組工程菌菌體細(xì)胞具有高效的手性選擇還原COBE 生成S-CHBE 的能力，轉(zhuǎn)化過(guò)程無(wú)需添加輔酶，這非常有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

圖7 雙重組菌耦合不對(duì)稱還原COBE 制備S-CHBEFig.7 Reduction of COBE to S-CHBE by E. coli BL21(DE3)/ pET28a-S1＇ and E. coli BL21 (DE3)/ pET28a-gdh

3 討論

S1 羰基還原酶(S1-KRED)屬短鏈醇脫氫酶家族，是Yasohara 等人從C. magnoliae AKU4643 分離得到的，顯示出高效、高選擇性催化COBE 合成SCHBE 的能力，目前對(duì)該基因的外源表達(dá)水平的研究主要集中在表達(dá)系統(tǒng)(啟動(dòng)子強(qiáng)度、載體性質(zhì))及表達(dá)條件等方面［6，8］。為了進(jìn)一步提高該酶在大腸桿菌中的表達(dá)效率，本研究在不改變氨基酸序列的情況下利用JCat 軟件對(duì)S1 基因序列進(jìn)行E. coli 密碼子偏嗜性優(yōu)化，獲得新的S1＇基因序列并人工合成S1＇序列，構(gòu)建重組菌E. coli BL21/pET28a-S1＇而實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)條件優(yōu)化后羰基還原酶活力達(dá)11.49 U/mg 蛋白，其表達(dá)效率優(yōu)于S1 基因序列，這說(shuō)明密碼子偏嗜性優(yōu)化是一種提高外源基因表達(dá)效率的有效手段。

大多數(shù)氧化還原酶用于催化制備手性醇、羥基酸、氨基酸等重要醫(yī)藥中間體過(guò)程中，往往需要輔酶NAD(P)H 的參與，這些輔酶價(jià)格昂貴，從而成為了限制氧化還原酶應(yīng)用的關(guān)鍵因素［15-16］。本研究利用重組菌E. coli BL21(DE3)/pET28a-S1＇與E. coli BL21(DE3)/pET28a-gdh 偶聯(lián)不對(duì)稱還原COBE 制備S-CHBE，在未添加任何輔酶的條件下實(shí)現(xiàn)了SCHBE 的高效還原制備，轉(zhuǎn)化10h 后產(chǎn)物摩爾得率達(dá)92.1%，其對(duì)映體過(guò)量值(e. e. )為100%，這對(duì)提高生物催化的原料經(jīng)濟(jì)性，降低生物催化生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用具有一定意義。

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