王丹妹，何 佟，吉麗敏，林 峰，林 容，林堂昌，莫燕娜

（1.海南醫(yī)學(xué)院機能室，海南 ?？?571101；2.海南省疾病預(yù)防控制中心結(jié)核所，海南 ?？?570203；3.海南省三亞市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，海南 三亞 572000）

肺結(jié)核病（PTB）是當(dāng)今世界單一致病菌引起死亡率最高的疾病，是由結(jié)核桿菌感染，在宿主自身和環(huán)境等因素之間復(fù)雜的相互作用引起的一種疾病。結(jié)核桿菌感染后是否發(fā)病，表現(xiàn)出明顯的個體差異，僅有10%的感染者表現(xiàn)出臨床癥狀，而大部分的感染者靠自身的免疫力抵抗結(jié)核桿菌的感染或成為健康帶菌者。有研究［1－3］表明：遺傳因素在決定宿主個體對結(jié)核桿菌的易感上起著重要作用。目前已證實：結(jié)核病的易感性與人類自然抵抗相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白1（NRAMP1）基因、維生素D受體（VDR）基因、人類白細(xì)胞抗原（HLA）－DR基因和TAP基因等有關(guān)。相對低分子質(zhì)量蛋白酶體（low molecular weight proteasome，LMP）是1982年Monaco在分析鼠MHC－Ⅱ類分子的免疫沉淀復(fù)合物過程中得到的一種產(chǎn)物，參與細(xì)胞漿中內(nèi)源性抗原的降解，水解抗原成為適合的肽段，并經(jīng)轉(zhuǎn)運后能夠與MHC－Ⅰ類分子連接，且表達在細(xì)胞表面，然后被CD8＋T淋巴細(xì)胞所識別，LMP對于機體的內(nèi)源性與外源性抗原的免疫應(yīng)答有著非常重要的作用。有研究［4－7］報道：LMP基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與一系列免疫相關(guān)性疾病的發(fā)生有著十分密切的關(guān)聯(lián)性。但目前未見LMP基因的多態(tài)性與結(jié)核病相關(guān)性的研究報道。為研究LMP基因的多態(tài)性與黎族人肺結(jié)核病的關(guān)系，本文作者選取LMP2、LMP7基因中具有氨基酸改變的2個多態(tài)位點（Codon60／Codon145），對海南黎族正常人群和結(jié)核病患者進行了SNP位點的檢測，并對其進行了易感性的關(guān)聯(lián)分析。

1 資料與方法

1.1 研究對象 病例組：2006—2008年在海南黎族人居住較多的地區(qū)本文作者共采集黎族肺結(jié)核患者205例，其中白沙縣37例，五指山市32例，昌江縣75例，三亞市20例，東方市41例，均為經(jīng)當(dāng)?shù)亟Y(jié)核防治所和海南省結(jié)核防治所根據(jù)臨床表現(xiàn)和胸部X線、痰涂片陽性確診的肺結(jié)核患者。按國家統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進行診斷，即痰菌陽性同時胸部X線片有肺結(jié)核特征病灶；或痰菌陰性，但胸部X線片示活動性肺結(jié)核征像，PPD試驗強陽性并具有明顯肺結(jié)核臨床體征者；同時排除肺癌、肺炎、塵肺、糖尿病和腫瘤等免疫功能低下者，未使用腎上腺皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑，無HIV感染。其中男性138例，女性67例，年齡18～79歲，平均年齡（41.90±16.77）歲，每例患者由當(dāng)?shù)亟Y(jié)核防治所協(xié)助采集靜脈血。

對照組：在海南黎族人居住較多的地區(qū)隨機選取與病例組無血緣關(guān)系的健康人群作為對照組，經(jīng)詳細(xì)詢問家族史確定為黎族，經(jīng)病史詢問以及常規(guī)體格檢查確定健康狀況良好，無長期用藥史，均經(jīng)胸部X線檢查，排除有肺結(jié)核病史。對照組研究對象共217例，其中男性105例，女性112例，年齡18～84歲，平均年齡（37.25±13.97）歲，標(biāo)本采集與病例組相同。在標(biāo)本采集的同時收集每個研究對象詳細(xì)的人口學(xué)資料、吸煙史和飲酒史等資料。所有研究對象均由專業(yè)人員進行現(xiàn)場問卷調(diào)查。

1.2 提取基因組DNA 抽取每例研究對象靜脈血2mL，用全血基因組快速提取試劑盒（天為時代公司）提取外周血細(xì)胞DNA。

1.3 多態(tài)性位點的選擇及引物設(shè)計 LMP2／LMP7基因位于染色體6p21.3區(qū)域，根據(jù)文獻選擇上述2個基因各自位于第二外顯子的2個SNP位點［1，7］：LMP2－Codon60處多態(tài)位點的存在使得所編碼的精氨酸（Arg）置換為半胱氨酸（Cys）；LMP7－Codon145處位點則為谷氨酰胺（Gln）置換為賴氨酸（Lys），在 GenBank（GenBank accession number：AF027865）中檢索到LMP2／LMP7基因的全長序列，利用Primer 5.0軟件，設(shè)計針對LMP2／LMP7中每個位點的PCR擴增引物，引物由上海申友生物技術(shù)有限公司合成，測序引物均分別采用各自上游引物。見表1。

1.4 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） PCR體系總體積為50μL：其中上下游引物各1μL（20mol·L－1），DNA模板4μL（500ng），Taq DNA聚合酶0.5μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min；94℃變性40s，退火40s，溫度分別為56.5℃（LMP2－Codon60）、57.0℃（LMP7－Codon145），72℃延伸40s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。

1.5 基因多態(tài)性分析 采用RFLP法進行基因多態(tài)性分析。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，取PCR產(chǎn)物10μL（DNA約1μg）、加限制性內(nèi)切酶HhaⅠ、BsmⅠ（BIOLABS公司）對LMP2－Codon60、LMP7－Codon145位點進行酶切。取酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳條帶數(shù)判斷每一個體LMP2／LMP7的基因型，由北京天根生化公司對不同基因型進行結(jié)果測序驗證。見表2。

表1 LMP基因多態(tài)性位點與引物序列Tab.1 Polymorphism sites of LMP and primer sequences of LMP gene

表2 LMP基因限制性內(nèi)切酶酶切片段長度、識別位點、所需溫度和時間Tab.2 Restriction fragment length，recognition site，required temperature and time of LMP gene

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用卡方檢驗驗證病例組與對照組之間基因型頻數(shù)是否符合Hardy－Weinberg平衡定律；多態(tài)性與結(jié)核桿菌感染風(fēng)險之間的相關(guān)性以比值比（OR值）及其95%可信區(qū)間（95%CI）表示，OR值及其95%CI以非條件Logistic回歸模型分析，均經(jīng)年齡、性別等混雜因素校正。

2 結(jié) 果

2.1 PCR與酶切結(jié)果 采用PCR－RFLP法對病例組和對照組人群進行LMP2／LMP7擴增后產(chǎn)物進行檢測。擴增產(chǎn)物經(jīng)HhaⅠ酶切后，LMP2可觀察到3種不同的基因型：330bp長度的多態(tài)純合型（Cys／Cys）；79和251bp 2條區(qū)帶的野生純合型（Arg／Arg）；79、251和330bp 3條區(qū)帶的雜合型（Arg／Cys）。LMP7也觀察到3種不同的基因型：351bp長度的多態(tài)純合型（Lys／Lys）；146和205bp 2條區(qū)帶的野生純合型（Gln／Gln）；146、205和351bp 3條區(qū)帶的雜合型（Gln／Lys）。

2.2 LMP2／LMP7測序結(jié)果 通過對病例組患者與對照組健康人群的2個基因多態(tài)性位點分別進行雙側(cè)測序法直接測序，結(jié)果顯示：LMP2／LMP72個位點在進行檢測的樣本中，均存在多態(tài)性。LMP2－Codon60處位點存在由C變?yōu)門的多態(tài)性，其多態(tài)性致使編碼的LMP2蛋白第60位密碼子由CGC置換成TGC，即導(dǎo)致氨基酸由原來的精氨酸（R）改變?yōu)榘腚装彼幔–）；LMP7－Codon145處位點存在C→A的多態(tài)性，該多態(tài)性致使編碼的LMP7蛋白的第145位密碼子由原來的CAG置換為AAG，即相應(yīng)地導(dǎo)致氨基酸由原來的谷氨酰胺（Q）變?yōu)橘嚢彼幔↘）。

2.3 Hardy－Weinberg平衡檢驗 對病例組和對照組人群中2個多態(tài)位點進行酶切檢測，讀取各3種基因型數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計，經(jīng)檢驗其等位基因頻數(shù)的分布符合Hardy－Weinberg平衡定律（P＞0.05）。

2.4 病例組和對照組LMP／LMP7多態(tài)性位點基因型頻數(shù) LMP2－Codon60位點多態(tài)性：病例組與對照組比較，野生純合型Arg／Arg（R／R）、雜合型 Arg1／Cys（R／C）和多態(tài)性純合型Cys／Cys（C／C）之間基因型頻數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。LMP7－Codon145位點多態(tài)性：病例組的雜合型頻數(shù)、多態(tài)性純合型分布明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。野生純合型Gln／Gln的基因型頻數(shù)與純合型Lys／Lys比較，OR＝3.77，95%CI［1.60，8.89］（P＜0.05）； 與雜合型Gln／Lys比較，OR＝2.97，95%CI［1.80，4.90］（P＜0.01）。見表3。2.5 海南黎族結(jié)核病與LMP2基因多態(tài)性各基因型的風(fēng)險關(guān)聯(lián)分析 多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)：病例組與對照組多態(tài)性純合基因型（Cys／Cys）和雜合基因型（Arg／Cy1），分別與野生純合基因型（Arg／Arg）比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；結(jié)果顯示：在海南結(jié)核病高發(fā)區(qū)，黎族人群中的LMP2－Coden60位點的多態(tài)性與結(jié)核病風(fēng)險可能不存在關(guān)聯(lián)性。

表32 組LMP2／LMP7多態(tài)性位點基因型頻數(shù)Tab.3 Genotypic frequencies of LMP／TAP SNP sites in two groups ［n（η／%）］

3 討 論

結(jié)核病是當(dāng)今世界由單一致病菌引起死亡率最高的疾病之一，全球約有1／3人口感染結(jié)核分枝桿菌，每年約有900萬新發(fā)的結(jié)核病患者，300萬人死于結(jié)核病。中國是全球22個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，世界衛(wèi)生組織評估顯示：目前中國結(jié)核病年發(fā)病人數(shù)約為130萬，占全球發(fā)病人數(shù)的14%，位居全球第2位。80%結(jié)核患者主要分布在老少邊窮的地區(qū)。黎族是唯一分布在海南省的少數(shù)民族，本課題組成員的前期研究［8］結(jié)果顯示：海南黎族人群痰液涂片中，結(jié)核桿菌陽性檢出率達到13.1%，高于同期各市縣漢族人群9.9%的平均水平。除了經(jīng)濟和醫(yī)療水平落后等因素影響外，宿主個體遺傳因素可能在結(jié)核桿菌的易感上也有重要作用。

國內(nèi)外對 LMP2基因多態(tài)性位點的研究［1，7，9］大多定位于這一基因的第60位編碼氨基酸處。本研究對所有的結(jié)核病患者樣本和健康對照人群的總樣本檢測過程中發(fā)現(xiàn)：LMP2－Codon60處位點由CGC中的堿基C處發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點的存在，即由堿基C置換為堿基T（CGC→TGC），此堿基的多態(tài)性的變化致使精氨酸成為半胱氨酸，因而這一堿基的改變同時也造成酶切位點的喪失。本研究結(jié)果與戴悅等［6－7］的研究報道相符。

LMP7－Codon145位點由CAG中的堿基C置換為A，其多態(tài)性使編碼氨基酸谷氨酰胺（Q）變?yōu)橘嚢彼幔↘）（Gln→Lys），即相應(yīng)地由不帶電荷的谷氨酰胺轉(zhuǎn)為帶正電荷的賴氨酸。本研究結(jié)果顯示：海南黎族人群LMP7基因的多態(tài)性位點與上述一致；多態(tài)性雜合基因型與多態(tài)性純合基因型在病例組中的頻數(shù)分布明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在本研究病例組與對照組的關(guān)聯(lián)分析中：野生型純合Gln／Gln與多態(tài)性純合Lys／Lys之間基因型頻數(shù)的比較，OR＝3.77，95%CI［1.60，8.89］，結(jié)果顯示：LMP7－Codon145位點堿基編碼Lys組成的等位基因型Lys／Lys能夠增加結(jié)核病3.77倍的罹患風(fēng)險；野生型純合Gln／Gln與雜合型Gln／Lys之間基因型頻數(shù)分布比較，OR＝2.97，95%CI［1.80，4.90］，顯示雜合型Gln／Lys能夠增加結(jié)核病2.97倍罹患風(fēng)險。本研究結(jié)果表明：LMP7基因多態(tài)性是海南黎族人群肺結(jié)核的易感基因。其影響結(jié)核的易感性機制，可能是由于LMP水解內(nèi)源性抗原所得到的肽段羧基端多是堿性及疏水性氨基酸殘基［8］，其多態(tài)性可導(dǎo)致水解酶在作用過程中肽段性質(zhì)或者長度的改變，這一系列的變化，可能影響了機體對于結(jié)核病發(fā)生的免疫抵抗［7，9－10］。

LMP基因的多態(tài)性有著種族、民族、個體差異、不同人群的疾病易感性和藥物治療的敏感性以及對環(huán)境反應(yīng)的分子基礎(chǔ)、地域分布頻率差異性，也與眾多的免疫性疾病有著風(fēng)險關(guān)聯(lián)［13］。本研究在相對封閉并且環(huán)境與遺傳背景相對一致的海南黎族人群中，對LMP2和LMP7基因多態(tài)性與結(jié)核病風(fēng)險進行了關(guān)聯(lián)性研究，結(jié)果提示：LMP7基因多態(tài)性與海南黎族結(jié)核病有較強的易感關(guān)聯(lián)，本研究結(jié)果為海南黎族結(jié)核患者早期風(fēng)險性評估、早期診斷和優(yōu)選干預(yù)措施提供了更多依據(jù)。相對于遺傳易感因素來說，每個多態(tài)性位點的存在并不只是起著一個獨立的作用，其相互之間也存在著一定的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，所以LMP基因在結(jié)核病發(fā)生發(fā)展中的作用還有待進一步的研究。

［1］Wang D，Zhou Y，Ji L，et al.Association of LMP／TAP gene polymorphisms with tuberculosis susceptibility in Li population in China ［J］.PLoS one，2012，7（3）：e33051.

［2］吉麗敏，王丹妹，莫燕娜，等.中國海南黎族人群TAP1基因多態(tài)性與結(jié)核病的關(guān)聯(lián)性研究 ［J］.實用醫(yī)學(xué)雜志，2011，27（14）2515－2518.

［3］林 容，薄建萍，蔡望偉，等.NRAMP1基因DNA多態(tài)性與海南黎族人結(jié)核病易感性的研究 ［J］.實用臨床醫(yī)藥雜志，2008，12（1）：61－64.

［4］Casp CB，She JX，McCormack WT.Genes of the LMP／TAP cluster are associated with the human autoimmune disease vitiligo［J］.Genes Immun，2003，4（7）：492－499.

［5］Maksymowych WP，Adlam N，Lind D，et al.Polymorphism of the LMP2gene and disease phenotype in ankylosing spondylitis：no association with disease severity ［J］.Clin Rheumatol，1997，16（5）：461－465.

［6］戴 悅，寧 濤，李 坤，等.LMP2／LMP7基因多態(tài)性于人群中乙型肝炎病毒感染相關(guān)性研究 ［J］.北京大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2005，37（5）：508－512.

［7］曹邦偉，戴 悅，蓋郁慧，等.LMP2／LMP7基因編碼區(qū)多態(tài)性及胃癌易感無相關(guān)性 ［J］.世界華人消化雜志，2007，14（36）：3471－3476.

［8］林 峰，羅興雄.海南省黎族集居地初治涂陽肺結(jié)核病人隊列分析 ［J］.中國防癆雜志，2003，25（5）：302－304.

［9］Cao B，Tian X，Li Y，et al.LMP7and TAP2gene polymorphisms and HPV infection in esophageal carcinoma patients from a high incidence area in China ［J］.Carcinogenesis，2005，26（7）：1280－1284.

［10］李 坤，戴 悅，陰秀麗，等.中國華北地區(qū)人群TAP1基因多態(tài)性與乙肝的關(guān)聯(lián)性研究 ［J］.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2005，14（1）：66－70.

［11］王敬慧，宋長興，王甦民，等.人類白細(xì)胞抗原DRB1基因與肺結(jié)核的相關(guān)性分析 ［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2001，24（5）：302－305.

［12］Gomez LM，Camargo JF，Castiblanco J，et al.Analysis of IL1B，TAP1，TAP2and IKBL polymorphisms on susceptibility to tuberculosis ［J］.Tissue Antigens，2006，67（4）：290－296.

［13］李繼東，朱運奎，肖永久.結(jié)核易感基因的研究現(xiàn)狀 ［J］.臨床肺科雜志，2009，2（14）：219－220.

［14］蔡夢茵.LMP、TAP基因多態(tài)性與自身免疫病關(guān)系的研究進展 ［J］.國外醫(yī)學(xué)：內(nèi)科學(xué)分冊，2001，28（7）：294－297.