陳海云 寧德魯 李勇杰 吳 濤 李 瑞 毛云玲 陳少瑜

(云南省林業(yè)科學(xué)院，昆明，650204) (云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(云南省林業(yè)科學(xué)院))

油橄欖(OleaeuyopaeaL.)，木犀科(Oleaceae)木犀欖屬(OleaLinn.)植物，是世界著名的亞熱帶常綠木本油料樹種之一，由于其高含量的不飽和脂肪酸(近90%)［1］，日趨受到廣大消費(fèi)者的青睞。油橄欖原產(chǎn)于西亞和地中海地區(qū)，19世紀(jì)引種到美洲、澳洲和亞洲，從南半球的澳大利亞至北半球的蘇聯(lián)，許多國(guó)家都有分布［2］。油橄欖品種繁多，據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界各地油橄欖自產(chǎn)品種共計(jì)1 275個(gè)，中國(guó)現(xiàn)有登記品種共158個(gè)［3］?？梢?，油橄欖的栽培歷史悠久，種質(zhì)資源豐富，其中包含大量的野生種、半野生種和栽培種，而且不同地域間品種交換頻繁，導(dǎo)致同名異物或同物異名的現(xiàn)象十分普遍。分子標(biāo)記對(duì)品種的鑒定和分類，實(shí)質(zhì)上是直接在分子水平上對(duì)品種基因型的鑒定，其準(zhǔn)確度高、效率高且信息量大［4］，目前已被廣泛應(yīng)用于植物種質(zhì)資源鑒定、系譜關(guān)系分析等研究中。近年來，國(guó)外已有一些采用RAPD、AFLP、SSR和ISSR等分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行油橄欖品種鑒定和遺傳多樣性研究的報(bào)道［5-9］。我國(guó)于1964年開始油橄欖的引種，之后開展了大量的栽培和品種選育等方面的研究［10］，但對(duì)于油橄欖種質(zhì)分子標(biāo)記方面的研究還非常缺乏，僅見邱源等［11］采用RAPD技術(shù)對(duì)23個(gè)引種的油橄欖品種進(jìn)行過分類和鑒定研究，以及馬萬里等［12］運(yùn)用RAPD技術(shù)進(jìn)行了澳大利亞油橄欖品種的鑒定研究等極少的報(bào)道。由此，本研究擬采用成本低、穩(wěn)定性高、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性強(qiáng)的ISSR分子標(biāo)記技術(shù)［13］對(duì)云南省永仁縣油橄欖品種資源收集圃中的59個(gè)油橄欖引種和選育品種進(jìn)行遺傳多樣性和分子鑒定，為這些油橄欖品種資源的規(guī)范管理、進(jìn)一步的科學(xué)研究和開發(fā)利用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

分析材料來源于收集種植在云南省楚雄州永仁縣油橄欖品種(種質(zhì))資源收集圃的59個(gè)油橄欖品種(表1)。其中：包括41個(gè)引種品種(1～41)，內(nèi)含品種名字相同，但引種來源地不同的12個(gè)品種(科拉蒂、配多靈、愛桑、米扎、皮瓜爾等);13個(gè)國(guó)內(nèi)選育品種(42～55);4個(gè)只有編碼代號(hào)和引種來源地品種(56～59)。以嫩葉為提取基因組DNA的材料。采集嫩葉后放入裝有硅膠的自封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室置冰箱中-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 59個(gè)油橄欖品種原產(chǎn)地、來源及主要用途

1.2 基因組DNA的提取及ISSR－PCR擴(kuò)增

采用植物基因組DNA提取試劑盒(Tiangen)提取59個(gè)油橄欖品種的基因組DNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA，具體方法見文獻(xiàn)［14］。以提取檢測(cè)后的基因組DNA為模板，進(jìn)行ISSR引物(北京奧科鼎盛生物技術(shù)有限公司合成)篩選，篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性和重復(fù)性較高的引物用以ISSR分析。篩選出的清晰穩(wěn)定、多態(tài)性強(qiáng)的11條引物的序列、退火溫度見表2［14］。

擴(kuò)增體系(20 μL)：1×TaqBuffer，3.5 mmol·L-1Mg2+，0.4 mmol·L-1dNTPs，1.0 μmol·L-1引物，1.0 UTaqDNA聚合酶，20 ng DNA模板;反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，50～55℃退火30 s，72℃延伸2 min，40循環(huán);72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物于2.0%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為0.5×TBE，電泳電壓為4 V/cm，電泳結(jié)束后在凝膠紫外成像儀上觀察、拍照。

表2 用以ISSR擴(kuò)增的11條引物序列及退火溫度

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與遺傳分析

根據(jù)DNA Marker判讀電泳圖譜中擴(kuò)增條帶的分子量大小及有無，同一位點(diǎn)有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”。采用Excel軟件對(duì)膠板樣本條帶進(jìn)行轉(zhuǎn)化，構(gòu)建0/1數(shù)據(jù)矩陣。以Excel軟件的數(shù)據(jù)記錄為基礎(chǔ)，利用DCFA1.1軟件將ISSR譜帶統(tǒng)計(jì)結(jié)果轉(zhuǎn)換為POPGENE軟件適用文件，由POPGENE32軟件獲得多態(tài)性位點(diǎn)及其百分?jǐn)?shù)(PP，B)、基因的多樣性(H)及Shannon信息指數(shù)(I)等遺傳參數(shù)，根據(jù)POPGENE計(jì)算得到的Nei's遺傳距離和遺傳相似性系數(shù)，運(yùn)用NTSYSpc 2.10軟件進(jìn)行UPGMA法聚類分析，構(gòu)建59個(gè)樣品親緣關(guān)系樹狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物擴(kuò)增的多態(tài)性

用篩選出的11條ISSR引物對(duì)59個(gè)樣品進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見表3。圖1為引物823和引物855對(duì)部分樣品的擴(kuò)增圖譜。由表3可知，11條引物一共擴(kuò)增出106條DNA譜帶，平均每條引物擴(kuò)增9.63條帶。各條引物擴(kuò)增的條帶數(shù)為3～16不等。擴(kuò)增的條帶分布在300～2 600 bp之間，主要分布區(qū)間為500～1 500 bp。由擴(kuò)增圖譜(圖1)可以直觀看到，所有樣品有相同的擴(kuò)增位點(diǎn)，也有特異擴(kuò)增位點(diǎn)，一定程度上說明所分析的油橄欖品種間的同源性，以及其遺傳背景的復(fù)雜性和多樣性，這些特異擴(kuò)增位點(diǎn)也是各品種分子鑒別的依據(jù)。

圖1 引物823、855對(duì)部分油橄欖樣品的ISSR擴(kuò)增圖譜

由表3可見，106個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)中有99個(gè)為多態(tài)性位點(diǎn)，總的多態(tài)位點(diǎn)百分率為93.4%。其中：UBC-814、UBC-816、UBC-826 和 UBC-874 引物擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)位點(diǎn)百分率皆為100%;引物UBC-852擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)最少，多態(tài)百分率也最低，僅有66.67%。基因的多樣性(H)為0.325 7;Shannon信息指數(shù)(I)為0.462 1?？梢?，云南永仁縣油橄欖品種資源收集圃中收集的油橄欖品種資源具備了較高的遺傳多樣性和豐富的遺傳基礎(chǔ)，為進(jìn)一步的遺傳育種奠定了基礎(chǔ)。

表3 11個(gè)引物對(duì)59個(gè)品種的擴(kuò)增結(jié)果

2.2 UPGMA聚類結(jié)果

根據(jù)POPGENE計(jì)算得到各品種的Nei's遺傳距離和遺傳相似性系數(shù)，運(yùn)用NTSYSpc 2.10軟件進(jìn)行UPGMA法聚類分析，構(gòu)建59個(gè)品種親緣關(guān)系樹狀聚類圖(圖2)。圖2中以遺傳距離0.171處作一結(jié)合線，可以將所有59個(gè)品種分成4個(gè)大類：第Ⅰ類有6個(gè)品種，除引種自達(dá)州的奧托卡和米扎兩個(gè)引種品種外，其他4個(gè)品種皆為昆明本地選育的品種，包括3個(gè)雜交品種和1個(gè)親本;第Ⅱ大類只有切拉姆和米扎(廣元)2個(gè)品種;第Ⅲ大類由國(guó)內(nèi)選育和部分引種，共24個(gè)品種組成，而且大多引種自武都;第Ⅳ大類共有27個(gè)品種，其中21個(gè)為引種品種，主要來源于希臘和廣元，只有2個(gè)品種(城固31和城固32)為國(guó)內(nèi)選育的品種，還有4個(gè)只知編碼代號(hào)和引種來源地品種。

在遺傳距離0.154處的4個(gè)大類又可以分別分成若干亞類(圖2)。第Ⅰ大類可分為2個(gè)亞類Ⅰ-ⅰ和Ⅰ-ⅱ，每個(gè)亞類各包含了3個(gè)品種。第Ⅲ大類包含2個(gè)亞類：Ⅲ-ⅰ含有以國(guó)內(nèi)選育品種為主的13個(gè)品種，著名的果用品種阿斯和盧克斯被聚于此亞類中;Ⅲ-ⅱ含有以引種品種為主的11個(gè)品種。第Ⅳ大類被分為3個(gè)亞類：Ⅳ-ⅰ包含直接引種于希臘的4個(gè)品種柯基、柯基優(yōu)、貝翠麗-p、貝翠麗-t，以及引種自武都但原產(chǎn)地為法國(guó)的德坦彩;Ⅳ-ⅱ僅有莫約拉1個(gè)品種;Ⅳ-ⅲ亞類共有21個(gè)品種，其中15個(gè)為引種品種，主要來源于希臘和廣元，2個(gè)是國(guó)內(nèi)選育的品種(城固31和城固32);另外還含有4個(gè)未知身份的品種(M1～M4)。

2.3 親緣關(guān)系及分子鑒定

由POPGENE計(jì)算得到各品種的Nei's遺傳距離在0.1815～0.0178之間。在遺傳距離小于0.050之內(nèi)，豆果和豆果優(yōu)、M1和M3、柯基和柯基優(yōu)、貝翠麗-p和貝翠麗-t、配多靈(武)和配多靈(俞)、科拉蒂(武1)和科拉蒂(武2)、盧克斯和佛奧、雜交2號(hào)和雜交3號(hào)分別兩兩聚在一起，表明兩兩間的遺傳相似性較高，很有可能分別屬于同一品種，其中盧克斯和佛奧很有可能出現(xiàn)了同物異名;而名字相同、引種地不同的九峰(武都)和九峰(廣元)、愛桑(廣元)和愛桑(昆明)、米扎(廣元)和米扎(達(dá)州)以及皮瓜爾(希臘)和皮瓜爾(武都)卻兩兩分別聚在了不同的大類或亞類中，有可能出現(xiàn)了同名異物的現(xiàn)象;另外，引種自廣元的M1、M2、M3和M4聚在同一個(gè)亞類當(dāng)中，它們也具有較高的遺傳相似性，有可能從同一品種選育或引種而來。

圖2 59個(gè)油橄欖品種的UPGMA聚類圖

3 結(jié)論與討論

用篩選出的11條ISSR引物對(duì)59個(gè)油橄欖品種種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，在全部106個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)中有99個(gè)為多態(tài)性位點(diǎn)，總的多態(tài)位點(diǎn)百分率為93.40%，基因的多樣性為0.325 7;Shannon信息指數(shù)為0.462 1。表明油橄欖品種間的多態(tài)性比較高。這可能是廣泛的種質(zhì)起源以及漫長(zhǎng)的進(jìn)化和長(zhǎng)期的人工選育的結(jié)果［15］，這一結(jié)果從分子水平上初步證明了油橄欖種質(zhì)廣泛和復(fù)雜的遺傳背景。另一方面，也揭示了云南永仁縣油橄欖品種資源收集圃中收集的油橄欖品種資源具備豐富的遺傳基礎(chǔ)，這些資源為進(jìn)一步油橄欖種質(zhì)的開發(fā)和利用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

基于各品種的遺傳距離，采用UPGMA法進(jìn)行了59個(gè)品種的聚類，結(jié)果將59個(gè)品種聚成4個(gè)大類，其中第Ⅰ、第Ⅲ和第Ⅳ大類又分別分為若干亞類?？傮w上看，大多數(shù)引種品種并沒有按照地理起源(原產(chǎn)地)而更多是依據(jù)引種材料來源地和主要用途進(jìn)行聚類：著名的果用品種超克、貝拉聚于Ⅳ-ⅲ亞類中，盧克斯和阿斯聚于Ⅲ-ⅰ亞類中;84.6%的國(guó)內(nèi)選育品種皆歸類于第Ⅰ和第Ⅲ大類中;引種品種則聚于Ⅱ、Ⅳ大類中。可見，在漫長(zhǎng)的人類利用油橄欖種質(zhì)資源的過程中，由于廣泛、復(fù)雜的引種和選育，造成以生長(zhǎng)、經(jīng)濟(jì)性狀、抗性等為主要目標(biāo)的選擇壓力以及油橄欖種質(zhì)間頻繁的基因交流，進(jìn)而導(dǎo)致這樣的聚類結(jié)果。這一結(jié)果與Besnard等［16］、Annalida 等［17］的研究結(jié)果相似，他們的研究結(jié)果表明，由于不同地域間頻繁的品種交換，導(dǎo)致劃分的類群與其地理起源沒有明顯的關(guān)系，而與果實(shí)的大小和用途明顯相關(guān)。

由于油橄欖的栽培歷史悠久，種質(zhì)資源豐富，資源引種的渠道較多，再加上長(zhǎng)期的人工選育、管理不夠完善等因素，使得品種同名異物、同物異名的現(xiàn)象較為嚴(yán)重，給生產(chǎn)和科研帶來很多不便，從遺傳本質(zhì)上弄清楚所收集的種質(zhì)資源情況，對(duì)于更好地規(guī)范管理和利用這些資源具有非常重要的意義。正因?yàn)槿绱?，?guó)外有不少關(guān)于油橄欖品種分子鑒定的研究報(bào)道。比如：Terzopoulos等［18］對(duì)意大利栽培的31個(gè)油橄欖品種進(jìn)行了ISSR分析，結(jié)果表明，ISSR標(biāo)記在油橄欖品種中有較高的鑒定效率，可將供試品種完全區(qū)分開;Sanz-Cortés等［19］采用AFLP技術(shù)對(duì)10個(gè)西班牙品種進(jìn)行鑒定，通過相似系數(shù)分析對(duì)其命名進(jìn)行了更正。本研究基于ISSR標(biāo)記的聚類結(jié)果表明，在所收集的59個(gè)油橄欖種質(zhì)中也存在同物異名和同名異物的現(xiàn)象，并進(jìn)行了具體的分析。當(dāng)然這只是一個(gè)方面的信息資料，如果能結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和其他標(biāo)記信息進(jìn)行研究，則更能客觀和科學(xué)地鑒定和分類這些種質(zhì)資源，這也是下一步需要開展的工作。

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