林裕勝 王隆柏 吳學敏 周倫江* 邵良平

（1.福建農(nóng)林大學動物科學學院 福州 350002；2.福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所 福州 350013）

豬流行性腹瀉（Porcine Epidemic Diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）引起的豬的一種急性、高度接觸性腸道傳染病，發(fā)生于各種年齡豬，其中對哺乳仔豬的危害最為嚴重，以腹瀉、嘔吐和脫水為臨床特征。1978年英國首次報道PED，并確定為一種冠狀病毒引起的疾?。?］。在之后2年，Debouck P等在許多國家和地區(qū)對該病進行了血清學調(diào)查，結果都檢測到PEDV 特異性抗體的存在［2］。我國于1980年首次分離到PEDV，以后許多地區(qū)均有PED 發(fā)生的報道，且流行范圍逐漸擴大。崔現(xiàn)蘭等對26個省、市、自治區(qū)的調(diào)查表明，因PED 導致的豬死亡率占36 種豬病總死亡率的1.74%，同時PED 與TGE的混感率近年已上升至30.77%［3］。2011年甘海霞等應用RT-PCR 對來自廣東省34個縣144個不同規(guī)模豬場的216 份臨床豬糞樣的檢測結果表明，很多豬場普遍存在TGEV和PEDV，尤其以PEDV 感染更為嚴重，陽性率達27.8%［4］。為了進一步弄清福建省PEDV的分布和感染情況，2012-2013年上半年筆者對采自福建省62個規(guī)模豬場128 份發(fā)生腹瀉的病料進行了PEDV 病原學檢測，研究分析PEDV在豬群中的感染及流行規(guī)律，為豬流行性腹瀉的防治提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣品 2012-2013年上半年采集福建省9個地級市62個規(guī)模豬場的腹瀉樣品128 份，樣品組織經(jīng)剪碎、研磨，按1︰10 比例加TE 液稀釋，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 病毒RNA 提取試劑盒購置OMEGA 公司，病毒DNA 提取試劑盒購自ROCHE公司，PCR 擴增試劑盒購置北京全式金生物科技有限公司，AMV 酶、dNTP和DNA Marker-2000 購自TaKaRa 公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 參照GenBank 中已發(fā)表的PEDV、TGEV、PROV的基因序列，設計合成檢測引物。PEDV的檢測引物，Up-5’-ATGTCTAACGGTTCTATTCCCGTTG-3’，Down-5’-TTAGACTAAA TGAAGCACTTTCTCA-3’，預期片段為563 bp；TGE V 檢測引物，UP-5’-CTTCTAAATGGCCAACCAGGG AC-3’，Down-5’-CGAGCATCTCGTTTAGTTCGTT-3’，預期片段為1 168 bp；PROV 檢測引物，Up-5’-GTATGGTATTGAATATACCAC-3′，Down-5’-GATC CTGTTGGCCATCC -3’，預期片段為342 bp；其他病毒引物參考文獻［5］進行設計合成。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2.2 核酸提取 采用病毒RNA/DNA 提取試劑盒，參照操作說明，分別提取組織樣品的總RNA/D NA，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RT-PCR 或PCR 病原檢測 采用北京全式金生物科技有限公司RT-PCR 擴增試劑盒，按照試劑盒提供的操作手冊配制反應體系，RT-PCR 反應體系：Total RNA 4μL、5×TransScriptTM All-in-One SuperMix for PCR 4μL、Rnase-free Water 12μL，反應條件：25 ℃10 min，42 ℃30 min，85 ℃5 min。

PCR 反 應 體 系：2×GoTaq Master Green Mix 12.5μL，上下游引物各0.5μL，cDNA 或DNA 模版3μL，無菌去離子水8.5μL，混勻后進行擴增，條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，53～61℃復性30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。取7μL 進行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。

1.4 PEDVORF3和M 基因遺傳進化分析 選取3個豬群發(fā)病嚴重的規(guī)模豬場采集的陽性PEDV 病料，擴增其ORF3和M 基因，將目的片段送生工生物工程（上海）有限公司進行測序，采用DNAstar 軟件進行遺傳進化分析。

2 結果與分析

2.1 PEDV 檢測結果 對2012年至2013年上半年福建省各縣市采集的128 份腹瀉病料進行PEDV、TGEV、PROV、CSFV、PRRSV和PRV 檢測。結果顯示：PEDV的陽性率為67.97%（87/128），其中PEDV和TGEV 混合感染為19.53%（25/128），PEDV和PROV 混合感染為3.91%（5/128），PEDV和PRV 混合感染為14.84%（19/128），PEDV 與PRRSV 混合感染為6.25%（8/128）。見表1，部分電泳圖見圖1。

表1 PEDV 檢測情況表

圖1 PEDV 檢測電泳圖

2.2 PEDV ORF3和M 基因遺傳進化分析 分別對發(fā)病嚴重的豬場采集的陽性病料進行了PEDV ORF3和M 基因擴增，均能擴增出目的片段。將陽性產(chǎn)物進行序列測序，獲得了3 株PEDV，命名為FJFZ、FJPT和FJ YX 毒株。通過軟件分析表明：3 株PEDV 在ORF3 基因劃分成2個主分支，其中FJFZ毒株與韓國毒株、中國大陸毒株處于一大分支，F(xiàn)JPT 毒株單獨于另一分支，F(xiàn)J YX 單獨處于一大分支，與attenuate DR13 弱毒株和致弱的CV777truncated 毒株的親緣關系較遠（見圖2）。3 株M 基因中以FJFZ 毒株和FJPT 毒株與CV777 標準毒株處于同于小分支，親緣關系較近，而FJYX 毒株單獨處于一大分支（見圖3）。

圖2 4 株PEDVORF3 基因核苷酸遺傳進化樹

圖3 4 株PEDV M 基因核苷酸遺傳進化樹

3 討論

1）2010年下半年以來，豬流行性腹瀉病毒造成了我國大量的小豬死亡，特別是對于飼養(yǎng)管理等條件不良的豬場，往往造成哺乳仔豬大量脫水、死亡。因此，該病成為嚴重影響我國養(yǎng)豬業(yè)健康的重要疫病之一。本次調(diào)查采集仔豬腹瀉病料的樣品，PEDV檢出陽性率高達60.8%，而且存在PEDV 與TGEV、PEDV 與PROV、PEDV 與PRV、PEDV 與PRRSV 混合感染，與臨近省市相比，福建省的PEDV 疫情相對嚴重，應該引起養(yǎng)殖場的重視。

2）鑒于近年來PED 發(fā)病嚴重，能導致90%以上的發(fā)病哺乳仔豬死亡，而且具有防控難的特點，多數(shù)從業(yè)人員懷疑流行毒株是否發(fā)生了遺傳變異。因此，筆者分別從3個發(fā)生嚴重腹瀉的豬場采集了3 份病料進行ORF3和M 基因序列測定，核苷酸遺傳進化樹分析表明，3 株PEDV 毒株的ORF3 基因和M 基因均存在基因突變，其中FJ YX 毒株與CV777 親緣關系較遠，M 基因片段與CV777和泰國流行毒株的親緣關系較遠。

［1］Pensaert M B，Debouck P.A New Coronavirus-like Particle Associated with Diarrhea in Swine［J］.Arch.Virol，1978，58：237-243.

［2］Debouck P，Pensaert M.Experimental Infection of Pigs with a New Porcine Enteric Coronavirus，CV 777［J］.Am J Vet Res，1980，41（2）：219-223.

［3］崔現(xiàn)蘭，馬思奇，王明，等.應用免疫熒光法診斷豬流行性腹瀉的研究［J］.中國畜禽傳染病，1990（5）：20-24.

［4］甘海霞，梁晟，韋顯凱，等.2011年廣西豬群豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎調(diào)查［J］.動物醫(yī)學進展，2012，33（10）：125-127.

［5］王隆柏，莊向生，周倫江，等.福建省規(guī)模豬場偽狂犬病流行病學調(diào)查與分析［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2008，35（11）：119-121.