王 健，鄭學仿，曹洪玉，張曉輝*

(1.大連大學環(huán)境與化學工程學院，遼寧大連 116622; 2.遼寧省生物有機化學重點實驗室，遼寧大連 116622)

1 引 言

1965年，Lipsett首先從大腸桿菌分離出4－thiouridylic acid，含硫及硫代類似物的DNA組成部分[如硫堿基(Thio－base) 和硫代核苷(thio－nuceloside)][1]。硫代DNA及硫代類似物擁有獨特的性質(zhì)，尤其是含硫堿基對紫外線的高靈敏度[2－7]。堿基(A，G，C，T)是DNA最主要的發(fā)色基團，其吸收光譜分布在紫外短波區(qū)(260～270 nm)，而含硫類似物則在紫外長波區(qū)(UVA)有吸收。徐耀忠等發(fā)現(xiàn)4－硫胸苷與UVA光作用能選擇地破壞DNA，高選擇性的殺死癌細胞，而對正常細胞僅有很小的附帶損害[8－11]，為癌癥和其它疾病治療提供一種新型的光化學療法[12－15]。人血清白蛋白(HSA)是血漿中含量最豐富的載體蛋白，它能結(jié)合、運輸許多內(nèi)源和外源性化合物分子，是目前研究最多的一種蛋白質(zhì)[16]，常作為研究藥物與蛋白質(zhì)相互作用的模型蛋白[17]。因此，研究藥物分子與HSA之間的相互作用，有助于了解藥物在人體內(nèi)的運輸、分布和代謝情況，對于闡明藥物的藥理作用和藥物代謝動力學也具有非常重要的意義[18]。

本文設(shè)計合成了一種新的4－硫－5－碘尿苷化合物，發(fā)現(xiàn) 4－硫－5－碘尿苷的紫外光譜在 345 nm處有最大吸收，相對于5－碘尿苷對UVA光更敏感。利用計算與光譜學實驗相結(jié)合的方法，進一步研究了4－硫－5－碘尿苷與人血清白蛋白(HSA)的相互作用機制，為硫代核苷對HSA性能的影響提供了一定的實驗數(shù)據(jù)和理論根據(jù)。

2 實 驗

2.1 儀器與試劑

儀器:JASCO－UV560型紫外－可見分光光度計(日本);JASCO－FP6500型熒光分光光度計(日本);JULABO－F12型制冷和加熱循環(huán)器(德國，±0.01℃);J－810圓二色分光光度計(日本 Jasco公司);PHB－4酸度計(上海雷磁儀器廠);FA1004電子天平(上海精科天平廠)。

試劑:HSA(去除脂肪酸和球蛋白，Sigma公司，純度為99%);三羥甲基氨基甲烷(Tris，上海生化試劑廠);尿嘧啶核苷(Sigma公司，純度98%)。所用的其它試劑均為分析純。實驗用水為二次去離子蒸餾水，無熒光雜質(zhì)。首先配制0.05 mol/L，pH 為7.40 的 Tris－HCl的緩沖溶液，然后用該 Tris－HCl溶液分別配制濃度為1.0 μmol/L的HSA溶液，以及濃度為1.0 mmol/L的4－硫－5－碘尿苷備用。

2.2 4－硫－5－碘尿苷的合成

4－硫－5－碘尿苷的合成路線如圖1所示。

圖1 4－硫－5－碘尿嘧啶核苷的合成路線Fig.1 The synthesis route of 4－thio－5－iodouridine

2.2.1 5－碘尿嘧啶核苷的合成(2)

將化合物尿苷(0.98 g，4.00 mmol)(1)溶于20 mL 0.3 mol/L的稀硝酸中，加入碘單質(zhì)(1.02 g，4.00 mmol)，110 ℃油浴加熱40 min(TLC 跟蹤監(jiān)測)。反應結(jié)束后熱過濾，濾液用石油醚萃取3次后，靜置于4℃冰箱中冷卻，過濾干燥得到白色針狀晶體(2)1.26 g，收率 75.32%。

m.p.:207～208 ℃ (文獻值 208 ～210℃)[19]。1H NMR(400 MHz，DMSO－d6)δ:3.54 ～3.73(m，2H，H－5'，5″)，3.89(d，J=4.0Hz，1H，H－4')，4.00(dd，J=4.0 Hz，8.0 Hz，1H，H－3')，4.05(dd，J=4.0 Hz，8.0 Hz，1H，H－2')，5.10，5.29，5.44(d，t，d，1H，1H，and 1H，OH's)，5.74(d，J=4.0 Hz，1H，H－1')，8.50(s，1H，H－6)，11.71(brs，1H，N—H)。UV(in CH3CN):λmax=280 nm。

2.2.2 2'，3'，5'－O－三氧乙?；?－碘尿嘧啶核苷(3)的合成

將化合物5－碘尿苷(1.00 g，2.70 mmol)(2)溶于15 mL無水吡啶中，冷卻至0℃，加入無水乙酸酐(3 mL，32 mmol)，在0℃下繼續(xù)攪拌5 h(TLC跟蹤監(jiān)測)。反應結(jié)束后，減壓蒸出溶劑，用95%乙醇重結(jié)晶，得到白色晶體(3)1.23 g，收率 91.83%。

m.p.:177 ℃ (文獻值 177 ～ 178 ℃)[20]。1H NMR(400 MHz，DMSO－d6)δ:2.06，2.07，2.08(3s，3H，3H，3H，OAc's)，4.21～4.27(m，2H，H－5'，5″)，4.31 ～4.36(m，1H，H－4')，5.33 ～5.35(m，1H，H－3')，5.47(dd，J=8.0 Hz and J=8.0 Hz，1H，H－2')，5.88(d，J=4 Hz，1H，H－1')，8.18(s，1H，H－6)，11.83(brs，1H，NH)。UV(in CH3CN): λmax=226.5 nm。

2.2.3 2'，3'，5'－O－三氧乙?；?－硫－5－碘尿嘧啶核苷(4)的合成

將化合物 2'，3'，5'－O－三乙酰基－5－碘尿苷(1.00 g，2.01 mmol)(3)溶于30 mL 無水二氧六環(huán)中，加入五硫化二磷固體(0.85 g，3.84 mmol)，回流加熱1.5 h(TLC跟蹤監(jiān)測)，整個體系處于N2保護條件下。反應結(jié)束后，減壓除去溶劑，粗產(chǎn)品通過硅膠層析分離，得到黃色油狀產(chǎn)物0.76 g(4)，收率 73.82%。

1H NMR(400 MHz，DMSO－d6) δ:2.07，2.07，2.09(3s，3H，3H，3H，OAc's)，4.23～4.31(m，2H，H－5'，5″)，4.33 ～ 4.36(m，1H，H－4')，5.37(dd，J=4 Hz，8 Hz，1H，H－3')，5.51(dd，J=4.0，4.0 Hz，1H，H－2')，5.86(d，J=4 Hz，1H，H－1')，8.28(s，1H，H－6)，13.16(brs，1H，NH)。

2.2.4 4－硫－5－碘尿嘧啶核苷(5)的合成

將 2'，3'，5'－O－三 乙 酰 基－4－硫－5－碘 尿 苷(0.51 g，1.00 mmol)(4)溶于甲醇的氨氣飽和溶液(60 mL，1.50 mmol)中，在室溫下密閉攪拌4.5 h。反應結(jié)束后，減壓蒸出溶劑，粗產(chǎn)品通過硅膠層析分離，得到黃色固體0.47 g(5)，收率71.14%。

m.p.:173 ～174 ℃。1H NMR(400 MHz，DMSO－d6)δ:13.00(s，1H，N—H)，8.68(s，1H，H－6)，5.68(d，1H，J=4 Hz，H－1')，5.40，5.30，5.10(d，t，d，1H，1H，and 1H，OH's)，4.06(dd，1H，J=4Hz，J=4 Hz，H－2')，3.88 ～ 3.90(m，1H，H－3')，3.72(dd，1H，J=4 Hz，J=4 Hz，H－5')，3.58(dd，1H，J=4 Hz，J=4 Hz，H－5″)。UV(in CH3CN):λmax=349 nm。IR λmax(film)/cm－1:1 701.6( ==amide C O)，1 590.2(C==S)。HR－MS for M++1 calcd m/z 386.935 1，calcd for C9H12IN2O5S found 386.943 3。

2.3 實驗方法

2.3.1 紫外吸收光譜

移取2 mL 1.0 μmol/L的HSA于1 cm 的石英比色皿中，用微量進樣器逐次加入適量的4－硫－5－碘尿苷溶液(累計體積不超過50 μL)，每次加入溶液后靜置3 min，測定220～450 nm的紫外吸收光譜。

2.3.2 熒光光譜

288 K 時，移取 2.5 mL 1.0 μmol/L 的 HSA于1 cm的石英比色皿中，用微量進樣器逐次加入適量的濃度為1.0 mmol/L 的 4－硫－5－碘尿苷溶液進行熒光滴定(累計體積不超過50 μL)，每次加入溶液后靜置3 min，以280 nm為激發(fā)波長，測定290～450 nm波長范圍內(nèi)HSA的熒光光譜以及HSA在4－硫－5－碘尿苷作用下的熒光猝滅光譜。按同樣的方法測定298 K和308 K下相應的熒光光譜。

2.3.3 圓二色光譜

298 K 時，移取 0.5 mL 1.0 μmol/L 的 HSA于1 mm的石英比色皿中，用微量進樣器依次加入適量的濃度為1.0 mmol/L 的 4－硫－5－碘尿苷溶液，每次加入溶液后靜置3 min，在 CD上測定190～250 nm范圍內(nèi)的圓二色譜。

3 結(jié)果與討論

3.1 4-硫-5-碘尿嘧啶核苷與HSA相互作用的紫外吸收光譜

蛋白質(zhì)中包含3個殘基:色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)，由于它們的生色基團不同而有不同的紫外吸收，其中Trp以及Tyr在280 nm波長附近有一個吸收峰[21]。圖2為在HSA中加入不同量比的4－硫－5－碘尿苷后，280 nm下的吸光度值。從實驗結(jié)果可知，加入4－硫－5－碘尿苷后，HSA的吸光度值有規(guī)律地下降，因此可以初步判定，4－硫－5－碘尿苷與 HSA之間有結(jié)合，發(fā)生了相互作用[22]。

圖2 HSA－(4－硫－5－碘尿苷)體系的紫外吸收光譜 (T=298 K)。Fig.2 UV absorption spectra of HSA－ISU system(T=298K).

3.2 4-硫-5-碘尿苷與HSA相互作用的熒光光譜

圖3 HSA－4－硫－5－碘尿苷體系的熒光光譜。Fig.3 Emission spectra of HSA in the presence of various concentrations of 4－SIU.

蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要來源于色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)3個殘基，三者的熒光發(fā)射峰是相互重疊的。由于蛋白質(zhì)的熒光通常在280 nm或更長的波長被激發(fā)，而Phe在絕大多數(shù)實驗條件下不能被激發(fā)，所以很少能觀察到Phe的發(fā)射，這樣蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要來自Trp和 Tyr殘基[23]。從圖3可知，使用280 nm為激發(fā)波長時，HSA的熒光發(fā)射峰主要來自于Trp和 Tyr殘基，而4－硫－5－碘尿苷在掃描范圍內(nèi)基本無熒光;隨著 4－硫－5－碘尿苷的加入，HSA的熒光強度有規(guī)律降低，說明4－硫－5－碘尿苷能使HSA的熒光猝滅，兩者之間存在相互作用，我們將進一步對其熒光猝滅機理進行探討。

3.3 熒光猝滅機理

3.3.1 4－硫－5－碘尿苷與 HSA 的猝滅常數(shù)

導致HSA熒光猝滅的原因可能為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。動態(tài)猝滅是由于猝滅劑和熒光分子間的彼此擴散和碰撞而導致的熒光強度減弱，是一種能量轉(zhuǎn)移或電子轉(zhuǎn)移的過程，不影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生理活性。靜態(tài)猝滅則是由于發(fā)生了配合作用，通常是生成了不發(fā)熒光的復合物，從而導致熒光物質(zhì)的熒光強度減弱。對于靜態(tài)猝滅，溫度升高會導致基態(tài)配合物的穩(wěn)定性下降，因此靜態(tài)猝滅常數(shù)隨溫度的升高而下降。為證實4－硫－5－碘尿苷的猝滅過程，將此過程按動態(tài) Stern－Volmer方程處理[24]:

式中F和F0分別為加入和不加入藥物HSA溶液的熒光強度;Kq為雙分子猝滅過程速率常數(shù);τ0為猝滅劑不存在時熒光體分子平均的壽命(生物大分子τ0約為10 ns)，在沒有猝滅劑存在的情況下，HSA 的熒光壽命 τ0=1.77 ns;[Q]為猝滅劑(4－SIU)的濃度;Ksv稱為動態(tài)猝滅常數(shù)。滴定時，4－硫－5－碘尿苷總體積小于 50 μL，遠小于 HSA 的總體積(2.5 mL)，可忽略體積變化。圖4為不同溫度下，F(xiàn)0/F 隨 4－硫－5－碘尿苷濃度變化的 Stern－Volmer圖，由圖中直線斜率可求出Ksv及Kq，結(jié)果如表1所示。

圖4 不同溫度下的4－SIU－HSA的Stern－Volmer曲線Fig.4 Stern－Volmer plots for the quenching of HSA fluorescence by 4－SIU－HSA at three different temperatures

通常動態(tài)猝滅常數(shù)Ksv隨著溫度的升高而增大，表1結(jié)果表明，隨著溫度的升高，4－SIU－HSA體系的Ksv反而減小，且實驗結(jié)果得出的動態(tài)猝滅速率常數(shù)Kq遠大于各類猝滅劑對生物大分子的最大擴散猝滅常數(shù) Kq=2.0×1010L·mol－1·s－1[25]。因此，可以推斷 4－硫－5－碘尿苷與人血清白蛋白體系的猝滅過程為形成配合物所引起的靜態(tài)猝滅，不是擴散和碰撞引起的動態(tài)猝滅。

表1 不同溫度下4-硫-5-碘尿苷與HSA的猝滅反應參數(shù)Table 1 Quenching reactive parameters of HSA and ISU at different temperatures

3.3.2 人血清白蛋白與 4－硫－5－碘尿苷相互作用的結(jié)合常數(shù)

根據(jù) Lineweaver－Burk 方程[26]

由(F0－F)－1對[Q]－1作 Lineweaver－Burk 雙倒數(shù)圖。從圖5可以看出曲線的線性關(guān)系良好，曲線的斜率隨著溫度的升高有所降低，通過直線斜率的倒數(shù)可分別求出不同溫度下的4－SIU與人血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)及相關(guān)系數(shù)(見表1)，由結(jié)合常數(shù)可知4－SIU－HSA之間有較強的結(jié)合力，并且受溫度影響不大，說明4－SIU可在體內(nèi)被蛋白質(zhì)貯存、轉(zhuǎn)運。

圖5 不同溫度4－硫－5－碘尿苷與 HSA 的 Lineweaver－Burk曲線圖Fig.5 Lineweaver－Burk line for the interaction HSA and 4－SIU

3.3.3 4－硫－5－碘尿苷與人血清蛋白之間的作用力

藥物小分子與生物大分子間的相互作用力包括氫鍵、范德華力、靜電引力及疏水作用力。通過反應前后熱力學參數(shù)(如焓變(ΔH)和熵變(ΔS))的變化可以判斷藥物與蛋白質(zhì)間作用力類型:△H＞0，△S＞0為疏水作用力;△H ＜0，△S＜0為氫鍵和范德華力;△H≈0或較小，△S＞0為靜電引力。對此我們研究了不同溫度條件下二者的結(jié)合常數(shù)，選擇的溫度范圍為15～45℃，此時HSA不經(jīng)受任何結(jié)構(gòu)的降解，當溫度變化不大時，反應的ΔH可以看作常數(shù)。根據(jù)Van't Hoff定律[27]:

在式(3)、(4)中，K為對應溫度下的結(jié)合常數(shù)，R為氣體常數(shù)。由lnK對1/T作圖6。

圖6 不同溫度4－SIU－HSA的Van't Hoff曲線圖Fig.6 Van't Hoff plot for the interaction of HSA and 4－SIU－HSA

由直線斜率和截距可以計算出ΔH和ΔS的值，通過式(4)可以計算出不同溫度下反應的ΔG。結(jié)果見表2。

表2 4-SIU與人血清白蛋白體系的熱力學參數(shù)Table 2 The related thermodynamic parameters of the 4－SIU HSA system at different temperatures

由表2 中數(shù)據(jù)可以看出，4－硫－5－碘尿苷與人血清白蛋白相互作用過程中的ΔG為負值。從熱力學角度來看，ΔG ＜0，說明4－硫－5－碘尿苷與人血清白蛋白之間的結(jié)合反應能夠自發(fā)進行。ΔH＞0，ΔS ＞0，表明 4－硫－5－碘尿苷與人血清白蛋白之間的作用力為典型的疏水作用力。

3.3.4 4－硫－5－碘－尿苷與 HSA 之間的能量轉(zhuǎn)移

通過F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，可以求出小分子(受體)在蛋白質(zhì)上的結(jié)合位置和與蛋白質(zhì)分子(供體)中產(chǎn)生熒光的基團之間的距離。理論指出發(fā)生能量轉(zhuǎn)移需要滿足以下3個條件[27]:(1)供體必須發(fā)射熒光;(2)供體的熒光發(fā)射光譜和受體吸收光譜之間有適當?shù)闹丿B;(3)供體與受體之間的距離r范圍為2～8 nm。

當能量供體和受體分子間距離為r及能量轉(zhuǎn)移效率為50%時，所對應的臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0及能量轉(zhuǎn)移效率E之間有如下關(guān)系[28]:

其中F0為供體的熒光強度;F為供體和受體濃度為1∶1時的熒光強度;K2指偶極空間取向因子，取給體與受體各向隨機分布的平均值2/3;N指介質(zhì)的折射指數(shù)，取水和有機物的平均值1.336;φ為無受體存在時能量給體的熒光量子產(chǎn)率，取HSA 中 Trp 的量子產(chǎn)率為 0.118[29];J 表示給體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜之間譜線的重疊的部分(圖7中陰影部分);F(λ)為熒光給體在波長為λ時的熒光強度;ε(λ)為受體在波長為λ時的摩爾消光系數(shù)。

根據(jù)圖7可以得到 J=3.66×10－14cm3·L·mol－1，代入式(5) 和(6) 得到 R0=2.13 nm，r=3.01 nm。2 nm ＜r＜8 nm 且滿足0.5R0＜r＜1.5R0[30]，說明HSA與ISU間存在非輻射能量轉(zhuǎn)移[31]，為 4－硫－5－碘尿苷與人血清白蛋白之間存在猝滅作用提供了理論依據(jù)。

圖7 HSA的熒光發(fā)射光譜和4－硫－5－碘尿苷的紫外吸收光譜(T=298 K)，c(HSA)=c(4－硫－5－碘尿苷)=1 μmol/L。Fig.7 Fluorescence emission spectra for HSA and UV absorbance spectra for ISU(T=298 K)，c(HSA)=c(ISU)=1.0 μmol/L.

3.4 4-硫-5-碘尿苷與人血清蛋白之間的圓二色光譜

圓二色光譜可以靈敏地檢測一些反應引起的蛋白質(zhì)分子二級結(jié)構(gòu)(如 α－螺旋、β－折疊、β－轉(zhuǎn)角以及無規(guī)卷曲等)的變化。圖8為4－硫－5－碘尿苷與HSA作用后的CD圖。圖中在208 nm和222 nm出現(xiàn)2個負槽，這是典型α－螺旋結(jié)構(gòu)的CD光譜信號。當4－硫－5－碘尿苷的濃度從 2.0 μmol/L 逐漸增加至14 μmol/L時，圓二色譜圖基本沒有發(fā)生變化(圖8)。結(jié)果表明，4－硫－5－碘尿苷對人血清白蛋白的二級結(jié)構(gòu)基本沒有改變，其通過血液作用于腫瘤細胞的過程中對人血清白蛋白的結(jié)構(gòu)影響很小，表明HSA是一種可以安全攜帶4－硫－5－碘尿苷藥物達到患處的載體蛋白[32]。

圖8 4－SIU與HSA相互作用的CD光譜圖Fig.8 Circular dichroism spectra of 4－SIU－HSA

4 結(jié) 論

基于硫堿基(thio－base)的易烷基化、易氧化、強紫外長波(UVA)吸收等獨特的性質(zhì)，以及核苷類化合物的抗腫瘤活性，設(shè)計合成了一種新化合物4－硫－5－碘尿苷。實驗以及理論計算的結(jié)果表明4－硫－5－碘尿苷與人血清白蛋白的熒光猝滅屬于靜態(tài)猝滅機制，二者主要靠疏水作用力結(jié)合。圓二色數(shù)據(jù)顯示4－硫－5－碘尿苷對HSA的二組結(jié)構(gòu)發(fā)生極其微弱的改變，表明此種抗癌藥物在人體內(nèi)只改變氨基酸所處的微環(huán)境，在把藥物安全輸送到腫瘤細胞的過程中，4－硫－5－碘尿苷對HSA沒有毒害作用。4－硫－5－碘尿苷與血液中其它蛋白的相互作用有待于進一步的研究，以闡明它的毒理機制。

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