俞 芳 福建省福清市畜牧獸醫(yī)中心龍山畜牧獸醫(yī)站 350300

肝臟是動(dòng)物體內(nèi)體積最大的實(shí)質(zhì)性腺體和重要的代謝器官，它不僅參與物質(zhì)代謝、生物轉(zhuǎn)化(解毒與滅活)、凝血物質(zhì)的生成和消除、膽汁的生成與排泄等等，而且因?yàn)槠湄S富的單核吞噬細(xì)胞，在特異和非特異免疫中也具有重要的作用。另外，肝臟在維持血糖水平相對穩(wěn)定的過程中起著關(guān)鍵作用，它可將血液中的葡萄糖轉(zhuǎn)化為肝糖原儲(chǔ)存起來，也可將儲(chǔ)存的肝糖原分解成葡萄糖參與氧化功能以及參與動(dòng)物體生長發(fā)育的調(diào)控［1］。

近來養(yǎng)殖業(yè)中的動(dòng)物肝病明顯增多。如乳牛、黃牛暴發(fā)的乙型肝炎；雞可發(fā)生乙型肝炎，脂肪肝綜合征；雛鴨病毒性肝炎、乙型肝炎；豬、羊、家兔均可發(fā)生乙型肝炎。而且發(fā)展迅猛，如雛鴨病毒性肝炎［2］，是一種高度致死性傳染病，在福建、江西等國內(nèi)養(yǎng)鴨比較集中的省區(qū)均有該病大規(guī)模發(fā)生和流行，發(fā)病率高達(dá)70%，死亡率高達(dá)85%。這些都嚴(yán)重威脅著養(yǎng)殖業(yè)主的經(jīng)濟(jì)利益和人們的健康。因此，對動(dòng)物肝臟疾病的有效治療和控制，是廣大獸醫(yī)科技工作者亟待解決的問題。試驗(yàn)以四氯化碳（CCl4）引起的急性肝損傷為對照組，比較檢測服用復(fù)方茵陳制劑后對動(dòng)物肝臟中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）指標(biāo)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥品 復(fù)方茵陳制劑，每克顆粒含0.564 g總藥材（生藥），由福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技研究所制；聯(lián)苯雙酯滴丸，北京協(xié)和藥廠生產(chǎn)，每丸1.5 mg，批號(hào)03120105。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 KM 小鼠，體重18～22 g，雌雄兼用，由福建醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.3 儀器和試劑 紫外分光光度計(jì)VIS-7220，北京瑞利分儀儀器公司；高速冷凍離心機(jī)Anke TGL-16G，飛鴿公司；微量移液器，德國eppendorf 公司；離心管（1.5 mL），由福建農(nóng)林大學(xué)藥品試劑科提供；Stotorius BS210S 電子天平(d=0.1g)，北京塞多利斯天平有限公司。CCl4、花生油、AST 、ALT 試劑盒均購自南京建成公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)前準(zhǔn)備及分組 將實(shí)驗(yàn)小鼠60 只隨機(jī)分為6 組，每組10 只，稱重。①為正常對照組（Ⅰ組，生理鹽水，0.3 mL/10g）；②CCl4模型組（Ⅱ組，生理鹽水，0.3 mL/10g）；③聯(lián)苯雙酯陽性對照組（Ⅲ組，2 mg/10g）；④～⑥為復(fù)方茵陳顆粒制劑高、中、低劑量組（Ⅳ組、Ⅴ組、Ⅵ組，按臨床成人50 kg 每日31 g生藥量的5倍、10倍、15倍折算為小鼠給藥量，分別為16.5 g/kg 體重、11 g/kg 體重、5.5 g/kg 體重）。正式試驗(yàn)前，所有動(dòng)物禁食不禁水12 h，用蒸餾水將復(fù)方茵陳顆粒配制成所需濃度的藥液，將CCl4用花生油稀釋成所需濃度。

1.2.2 模型的制備和給藥 給藥組每天灌胃給藥1 次，連續(xù)4 d，空白組和模型組灌同等體積生理鹽水。于給藥第3 d，除正常對照組外，其余5 組頸部皮下注射0.5%四氯化碳-花生油溶液（0.1 mL/10g），注射后禁食不禁水，16 h 后模型建立。

1.3 檢測指標(biāo)和方法 注射CCl416 h 后立即進(jìn)行眼眶采血，肝素抗凝，4 000 r/min 離心10 min，用微量移液器取上清液，裝入離心管，標(biāo)記。

AST、ALT的測定。分別吸取0.1 mL/支上清液，加入0.5 mL 天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基質(zhì)液均勻混合，37 ℃水浴30 min，再加0.5 mL 2，4-二硝基苯肼液，混勻后，37 ℃水浴20 min，之后加入5 mL 0.4 mol/L氫氧化鈉溶液，室溫放置10 min。在505 nm 波長，1 cm 光徑，蒸餾水調(diào)零，測各管的吸光度值，計(jì)算測定管（50 管）吸光度值與空白對照管（10 管）吸光度值差值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得相應(yīng)的AST 活力單位，記錄。

ALT（丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶）測定的操作過程同AST 測定，求得相應(yīng)的ALT 活力單位，記錄。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 結(jié)果采用SPSS11.0 統(tǒng)計(jì)軟件，用方差F 檢驗(yàn)、LSD 法比較組間和組內(nèi)差異顯著性。

2 結(jié) 果

觀察復(fù)方茵陳制劑對急性肝損傷小鼠血漿酶指標(biāo)的影響。由表1 可知，注射CCl416 h 后，II 組小鼠的血漿AST、ALT 比I 組分別提高111.63%和847.14%，差異極顯著（P＜0.01），說明肝功能明顯受損，造模成功。

用藥Ⅳ組、Ⅴ組、Ⅵ組的血漿AST 分別比II 組降低38.10%、32.23%、28.21%，差異極顯著（P＜0.01）。用藥Ⅳ組、Ⅴ組、Ⅵ組的血漿ALT 分別比II組降低72.25%、42.99%、34.24%，差異極顯著（P＜0.01）。

堿性磷酸酶（AKP）除Ⅲ組與I 組比較有顯著性差異外，其余組間均不存在顯著性。

表1 藥物對小鼠肝損傷血漿AST、ALT的影響（n＝10，±SD）

3 討論

3.1 肝損傷模型的選擇 最近幾年常用的動(dòng)物肝臟疾病模型有化學(xué)藥物中毒性肝炎模型（主要包括CCl4肝損傷模型、D-氨基半乳糖胺急性肝損傷模型、硫代乙酰胺肝損傷模型、α-萘異硫氰酸酯肝損傷模型、撲熱息痛肝損傷模型、異硫氰酸苯酯和硝硫氰胺肝損傷模型）、免疫性肝損傷模型（卡介苗免疫性肝損傷模型、脂多糖免疫性肝損傷模型）和其他肝損傷模型［3］。復(fù)方茵陳制劑主要是保肝降酶作用，所以，選擇CCl4急性肝損傷模型。而且CCl4是長期以來公認(rèn)的復(fù)制肝損傷動(dòng)物模型的化學(xué)物質(zhì)，我國衛(wèi)生部頒布的《中藥藥理實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)原則》中明確指定應(yīng)用CCl4肝損傷動(dòng)物模型進(jìn)行保肝降酶新藥的藥理實(shí)驗(yàn)，其模型成功率高，試驗(yàn)方法簡便，重復(fù)性好，結(jié)果穩(wěn)定［4］。

3.2 陽性對照組藥物的確立 目前臨床用于治療各種急性、慢性肝炎，已獲得藥品批準(zhǔn)文號(hào)的中成藥和西藥均可以作為陽性對照藥?；瘜W(xué)合成藥聯(lián)苯雙酯，是合成無味子丙素的一種中間體，對動(dòng)物有抗肝損傷作用，能增強(qiáng)肝臟解毒功能，臨床對肝炎病人肝功能障礙有治療作用，特別是降低血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶作用顯著，優(yōu)于國內(nèi)外同類藥品，已成為實(shí)驗(yàn)室研究的陽性對照藥［5］。

3.3 肝功能生化實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測 肝臟是人體物質(zhì)代謝的中心器官，行使著多種重要的代謝功能。肝細(xì)胞除了具有一般細(xì)胞所共有的代謝功能外，還有一些特殊的代謝功能，肝功能實(shí)驗(yàn)方法不下500 余種，但臨床常用的肝功能不過幾十種。血清中的AST、ALT 活力升高與肝組織損傷程度和范圍呈平行關(guān)系。整個(gè)肝內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶的量約為血清中的100倍，因此，只要1%的肝細(xì)胞壞死便足以使血清中活性增加一倍。又由于肝細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶濃度比血清高1 000～5 000倍，當(dāng)肝組織發(fā)生炎癥和損傷時(shí)，因能量代謝障礙而致細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶也可由于濃度梯度而泄漏入血，因此，血清轉(zhuǎn)氨酶活性是肝細(xì)胞損害的最敏感指標(biāo)。

3.4 復(fù)方茵陳制劑對小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用復(fù)方茵陳制劑是提取茵陳、黃芩、大黃、甘草等有效成分研制而成的復(fù)方中藥制劑。諸配方不僅充分發(fā)揮著本身的藥效作用，還互相配合，具有疏肝解郁，活血行氣散結(jié)之功能：（1）茵陳含有篙屬香豆素、色原酮類、茵陳二炔、脂肪油及茵陳多肽等有效成分，具有利膽作用；抗肝損傷作用；解熱鎮(zhèn)痛、消炎作用；免疫調(diào)節(jié)作用［5］。（2）黃芩，其含有的黃芩苷有降壓作用，降血脂作用，對由各種原因造成肝損傷動(dòng)物模型具有明顯的保護(hù)作用；黃芩素是一個(gè)很好的黃嘌呤氧化酶抑制劑，可用于治療肝炎，另外還有很強(qiáng)的抗氧化、抗腫瘤作用。（3）大黃具有清除肝細(xì)胞炎癥和膽汁淤積，清除氧自由基，減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護(hù)肝臟功能的作用［6］。（4）甘草可緩急止痛，調(diào)胃和肝。對四氯化碳所致的肝損傷有明顯保護(hù)作用，可減輕肝細(xì)胞變性和壞死，降低血清轉(zhuǎn)氨酶活力。明顯的抗脂質(zhì)過氧化作用。另外，還有抗炎、抗病毒、抗致突、解毒和抗氧化作用。

通過研究復(fù)方茵陳制劑對CCl4引起急性肝損傷整體模型的影響，發(fā)現(xiàn)其各劑量組均能不同程度明顯降低血漿AST、ALT等酶的含量，減輕肝臟的病理性損傷，表現(xiàn)出明確的保肝作用。

另外，芮箐等［7］報(bào)道了復(fù)方茵陳膠囊的利膽、降脂作用及對四氯化碳、α-異硫氰酸氖酯所致的肝損傷具有顯著的保護(hù)作用，能增加膽汁分泌，血清轉(zhuǎn)氨酶活性明顯降低。蘇立盛等［8］報(bào)道中藥肝靈對大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用，并說明其保肝機(jī)理為保護(hù)肝細(xì)胞膜，抗脂質(zhì)過氧化，促進(jìn)蛋白合成，調(diào)節(jié)免疫。這些都與本試驗(yàn)的結(jié)果相一致。

4 總結(jié)

隨著飼料工業(yè)的發(fā)展，抗生素和化學(xué)藥物對動(dòng)物的危害越來越受到人們的重視。而中草藥添加劑將進(jìn)入一個(gè)新的發(fā)展階段，因?yàn)樗?dú)特的作用方式、良好效果、無殘留、無抗藥性以及無污染而使其成為一種理想的飼料添加劑。

［1］李儀奎，王欽茂.中藥藥理試驗(yàn)方法學(xué)［M］.上海:科學(xué)技術(shù)出版社，1991:382.

［2］萬雪，王磊，寧官保，等.鴨病毒性I 型肝炎研究進(jìn)展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2005，32(8):57-59.

［3］黃正明，楊新波，曹文斌，等.化學(xué)性及免疫性肝損傷模型的方法學(xué)研究［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2005，21(1):42-46.

［4］張琪，陳輝，彭順利，等.急性肝損傷動(dòng)物模型具備研究進(jìn)展［J］.吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，8(4):216.

［5］陳奇.中藥藥理試驗(yàn)方法學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1993:837.

［6］張沛毅.當(dāng)歸對試驗(yàn)性肝損傷小鼠的抗自由基損傷作用［J］.中西結(jié)合肝病雜志，1996，6(4):21-22.

［7］芮箐，吳燕敏.復(fù)方茵陳膠囊的藥效學(xué)研究［J］.天津藥學(xué)，2004，16(1):7-9.

［8］蘇立穩(wěn)，盛國光，張建軍，等.中藥肝靈對大鼠急性肝損傷保護(hù)作用的試驗(yàn)研［J］.承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1998，15(1):9-11.