周 旋 肖向紅 張晶鈺 柴龍會(huì) 牛曙東 呂 晨

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

東北林蛙(Rana dybowskii)，屬脊索動(dòng)物門(mén)，兩棲綱，無(wú)尾目，蛙科。東北林蛙的養(yǎng)殖是我國(guó)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)之一，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近年來(lái)，東北林蛙種群數(shù)量逐年下降。研究顯示，蛙病毒屬的虹彩病毒(Rana grylio virus，RGV)是最重要的影響因素之一［1］。該病毒廣泛的宿主范圍、全球分布性以及高致病力，使得它們成為兩棲類(lèi)全球性的威脅。NF－κB是參與機(jī)體先天免疫的一類(lèi)重要模式識(shí)別分子，也是連接先天免疫和獲得性免疫的橋梁。研究證實(shí)，NF－κB信號(hào)通路是促炎癥基因表達(dá)的樞紐之一，可誘導(dǎo)細(xì)胞因子、趨化因子、粘附因子、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、環(huán)加氧酶2(cox2)和誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNos)的表達(dá)［2］。但目前對(duì)NF－κB信號(hào)通路的研究多集中在哺乳動(dòng)物，兩棲動(dòng)物的NF－κB相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以東北林蛙為研究對(duì)象，利用熒光定量PCR技術(shù)，觀察東北林蛙在受到RGV脅迫后，其體內(nèi)NF－κB和I－κB分子的時(shí)空表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)動(dòng)物及毒株:東北林蛙，40只，健康、雄性，2～3齡，體質(zhì)量(20±2)g，2012年5月購(gòu)自黑龍江省帽兒山林場(chǎng);蛙虹彩病毒RGV9506，由中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所張奇亞教授饋贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)并保存。

主要試劑:Trizol Reagent，由美國(guó) Invitrogen公司購(gòu)買(mǎi);瓊脂糖，由Biowest公司購(gòu)買(mǎi);GelRed核酸凝膠染料，由美國(guó)Biotium公司購(gòu)買(mǎi);2×Taq Master Mix、DNA Marker 2000、50 bp DNA Ladder，由天根生化科技有限公司購(gòu)買(mǎi);Prime Script? RT reagent Kit、Real Master Mix(SYBR ? Green Ⅱ)，由 Takara公司購(gòu)買(mǎi);小量膠回收試劑盒，由上海華舜生物有限公司購(gòu)買(mǎi)。

1.2 總RNA提取和檢測(cè)

東北林蛙經(jīng)腹腔注射RGV 1 mL［3］(PBS稀釋為106/mL)脅迫刺激。分別于 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0、24.0、48.0、72.0 h 后取背部皮膚、肝臟、脾臟，－80℃保存，以0 h為空白對(duì)照組。用Trizol法提取總RNA，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其吸光度。

1.3 RT-PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)

使用Primer premier 5.0軟件，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室高通量測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì) β－actin、NF－κB1、NF－κB2和 I－κBα mRNA的上下游引物，引物由哈爾濱博仕生物公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1 β－actin、NF －κB1、NF－κB2和 I－κBα 引物

取500 ng總RNA按照PrimeScript?RT reagent Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)(以β－actin為陽(yáng)性對(duì)照)。PCR反應(yīng)體系根據(jù)2×TaqMasterMix說(shuō)明書(shū)配制，反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min(94℃變性30 s，NF－κB1 56℃、NF － κB2 52.6 ℃、β －actin 54.5 ℃、I－ κBα 58.5℃退火30 s，72℃延伸1 min)，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.4 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

切膠回收目的基因PCR產(chǎn)物，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定回收產(chǎn)物吸光度及濃度，產(chǎn)物質(zhì)量濃度測(cè)定后，按下列公式計(jì)算各產(chǎn)物單位體積(單位:μL)的拷貝數(shù)(N)［4］:N=NA× C/MW。式中:NA為阿伏加德羅常數(shù);C為產(chǎn)物質(zhì)量濃度(單位:g/μL);MW為產(chǎn)物平均摩爾質(zhì)量(單位:g/mol，MW=片段長(zhǎng)度bp×660/bp)。

用已測(cè)質(zhì)量濃度的切膠回收產(chǎn)物為母液制備質(zhì)量濃度梯度樣品，在25 μL反應(yīng)體系中分別加入1 μL各稀釋質(zhì)量濃度的樣品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。熒光定量PCR反應(yīng)體系按照Real Master Mix(SYBR?GreenⅡ)說(shuō)明書(shū)配制，熒光定量PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s(95℃變性5 s，NF－κB1 56℃、NF－κB2 52.6 ℃、I－ κBα 58.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72℃讀板)，40個(gè)循環(huán)，95℃延伸15 s。在72～95℃區(qū)間，以0.5℃為遞增梯度進(jìn)行溶解曲線(xiàn)分析。采用默認(rèn)設(shè)置，自動(dòng)生成C(t)值，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

熒光定量PCR反應(yīng)體系按照Real Master Mix(SYBR?GreenⅡ)說(shuō)明書(shū)配制，熒光定量PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s(95℃變性5 s，NF－κB1 56℃、NF － κB2 52.6 ℃、I－ κBα 58.5 ℃退火 30 s，72℃延伸30 s，72℃讀板)，40個(gè)循環(huán)，95℃延伸15 s。在72～95℃區(qū)間，以0.5℃為遞增梯度進(jìn)行溶解曲線(xiàn)分析。每個(gè)基因的cDNA樣本重復(fù)3次。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用Opticon Monitor 3軟件分析定量結(jié)果，取C(t)值的均數(shù)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算各樣品拷貝數(shù)。同一部位不同樣本之間表達(dá)量差異顯著性檢驗(yàn)采用SPSS(18.0)的獨(dú)立樣本的T－test法。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取結(jié)果

利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取的各樣品組織總RNA的OD值，各樣本OD260/OD280全部在1.9～2.1之間，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總 RNA的18S、28S RNA條帶清晰(見(jiàn)圖1)，說(shuō)明樣本無(wú)RNA降解、蛋白質(zhì)污染，總RNA質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 東北林蛙組織總RNA電泳圖

2.2 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

取500 ng總RNA經(jīng)RT－PCR，得到目的條帶清晰(見(jiàn)圖2)，無(wú)特異擴(kuò)增及引物二聚體，測(cè)序結(jié)果與引物設(shè)計(jì)時(shí)片段大小相吻合，且無(wú)雜帶，表明反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和特異性引物均滿(mǎn)足后續(xù)Real－timePCR實(shí)驗(yàn)要求。測(cè)序結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室高通量測(cè)序結(jié)果一致。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

選用初始模板拷貝數(shù)適宜的目的基因標(biāo)準(zhǔn)品為母液制備質(zhì)量濃度梯度樣品(NF－κB2為9.7×(10－1～103)拷貝數(shù)/μL;NF －κB1為1.55×(101～105)拷貝數(shù)/μL;I－κBα為1×(101～105)拷貝數(shù)/μL)。對(duì)每個(gè)質(zhì)量濃度的樣品，設(shè)定3個(gè)重復(fù)。圖3展示的是各標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增產(chǎn)物起始模板質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值與對(duì)應(yīng)C(t)值的關(guān)系圖，NF－κB2、NF－κB1、I－κBα的標(biāo)準(zhǔn)方程的回歸系數(shù)均在0.97以上，表現(xiàn)出良好的線(xiàn)性關(guān)系。

圖2 目的基因RT－PCR產(chǎn)物電泳圖

圖3 目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.4 NF － κB1、NF －κB2和I－κBα 定量結(jié)果

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)RGV脅迫下，NF －κB1、NF－κB2和 I－κBα 在東北林蛙肝臟、脾臟、皮膚中10個(gè)時(shí)間點(diǎn)的時(shí)空表達(dá)情況。目的基因溶解曲線(xiàn)為一個(gè)明顯的峰(見(jiàn)圖4)，表明在擴(kuò)增中引物特異性較好，產(chǎn)物單一。C(t)值經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算出東北林蛙肝臟、脾臟、皮膚不同脅迫時(shí)間下的樣品初始拷貝數(shù)(見(jiàn)圖5)，在RGV刺激初期，與對(duì)照組相比形成NF－κB1和NF－κB2表達(dá)量立即大幅下調(diào)。從刺激后0.5 h，2個(gè)亞基在3個(gè)組織中都有上調(diào)趨勢(shì)，分別在刺激后2 h(肝臟)和4 h(皮膚)快速上調(diào)至峰值，NF－κB1和NF－κB2在肝臟中為760 bp和1082 bp、在皮膚中為551 bp和1 921 bp;在脾臟中2亞基上調(diào)趨勢(shì)緩慢，分別在16 h(NF－κB2)和24 h(NF －κB1)達(dá)到峰值，NF－κB1和NF－κB2分別為758 bp和659 bp。2亞基表達(dá)至峰值后開(kāi)始下調(diào)，并在8 h(在肝臟中)和12 h(在皮膚中)下調(diào)至初始水平，在脾臟中2亞基72 h才達(dá)到初始水平。I－κBα在受刺激初期表達(dá)量也立即下調(diào)而后上調(diào)，并且其上調(diào)時(shí)間與NF－κB的上調(diào)時(shí)間點(diǎn)基本相同。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，定量結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖4 目的基因溶解曲線(xiàn)圖

3 討論

隨著全球環(huán)境的變化，生物多樣性不斷受到破壞，作為衡量生態(tài)環(huán)境優(yōu)劣的指示動(dòng)物——兩棲動(dòng)物數(shù)量正逐年減少。引起兩棲動(dòng)物種群衰退的原因主要包括新引入的捕食者［5］、紫外線(xiàn)輻射的增加［6］、生境的破壞和退化、化學(xué)污染以及由病原微生物引起的感染性疾病的流行［7］等，其中感染性疾病流行與某些兩棲類(lèi)種群的區(qū)域性滅絕有重要的關(guān)聯(lián)［8］。已有研究表明，蛙病毒屬RGV也是兩棲動(dòng)物重要的病原之一［1］。RGV主要感染兩棲類(lèi)、爬行類(lèi)和硬骨魚(yú)類(lèi)［9］。Brunner等［10］研究顯示，實(shí)驗(yàn)室和野生條件下蠑螈(salamandrae)可作為病毒攜帶者而不發(fā)病，并在接觸RGV后能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答。

蛙類(lèi)皮膚光滑潮濕并且無(wú)角質(zhì)層保護(hù)，其皮膚能夠分泌具有抗微生物活性的物質(zhì)，作為抵御病原微生物入侵的第一道屏障;肝血竇的枯否氏細(xì)胞具有吞噬作用;脾臟作為最活躍的免疫器官是血源性抗原產(chǎn)生應(yīng)答的主要場(chǎng)所。謝簡(jiǎn)等［11］通過(guò)RGV人工感染美國(guó)青蛙(Rana grylio Stejneger)幼蛙經(jīng)免疫組化法檢測(cè)顯示，病毒感染呈現(xiàn)的陽(yáng)性反應(yīng)可深達(dá)肝脾臟的實(shí)質(zhì)層，推測(cè)肝脾組織可能是RGV感染的主要靶器官?；诖?，本實(shí)驗(yàn)以東北林蛙皮膚、肝臟和脾臟為靶器官，檢測(cè)RGV脅迫后各器官中NF－κB的表達(dá)變化。

圖5 NF－кB及I－кBα mRNA表達(dá)變化趨勢(shì)

核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF－κB)能與多種細(xì)胞基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列特定位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，在炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用。NF－κB位于Toll樣受體(TLR)下游信號(hào)通路的樞紐位置，當(dāng)細(xì)胞受到病原體刺激后產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，使NF－κB與I－κB解離，從而進(jìn)入細(xì)胞核，與相應(yīng)的靶序列結(jié)合，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，啟動(dòng)針對(duì)病原微生物的固有免疫和獲得性免疫。在果蠅中，NF－κB/Rel同源蛋白 Dorsal和Dif由Toll受體激活，分別在幼體和成體抗真菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的免疫應(yīng)答中起轉(zhuǎn)錄激活作用［12］。王冬冬［13］研究顯示，中國(guó)明對(duì)蝦在受白斑綜合癥病毒(WSSV)刺激后Relish(哺乳動(dòng)物NF－κB1和NF－κB2的同源蛋白)基因表達(dá)呈現(xiàn)先下調(diào)，而后上調(diào)，再下調(diào)，最后恢復(fù)正常水平的變化趨勢(shì)，并且可調(diào)控下游多種效應(yīng)因子對(duì)WSSV進(jìn)行免疫防御。

兩棲動(dòng)物是低等水生動(dòng)物過(guò)渡到真正陸生動(dòng)物的中間類(lèi)型，在脊椎動(dòng)物進(jìn)化史上有著重要地位。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)東北林蛙NF－κB的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，在不同組織中NF－κB1和NF－κB2兩個(gè)亞基的表達(dá)水平有差異，NF－κB2表達(dá)量約是NF－κB1的2倍，且皮膚和脾臟中的表達(dá)量明顯高于肝臟。在RGV刺激下，與對(duì)照組相比，NF－κB1和NF－κB2表達(dá)量立即大幅下調(diào);肝臟和皮膚中，在刺激后2 h(在肝臟中)和4 h(在皮膚中)上調(diào)至峰值;在脾臟中，2亞基上調(diào)趨勢(shì)緩慢，分別在16 h(NF－κB2)和24 h(NF－κB1)達(dá)到峰值;2亞基表達(dá)至峰值后開(kāi)始下調(diào)，并在8 h(在肝臟中)和12 h(在皮膚中)下調(diào)至初始水平，在脾臟中2亞72 h才達(dá)到初始水平。即:其表達(dá)變化呈現(xiàn)先下調(diào)，而后上調(diào)，再下調(diào)，最后恢復(fù)正常水平的趨勢(shì)，與WSSV刺激下對(duì)明蝦Relish基因的表達(dá)趨勢(shì)相同［13］。說(shuō)明在受刺激初期，主要由皮膚和肝臟起到對(duì)RGV的抵制作用，但是在刺激后期則主要有脾臟起免疫調(diào)控作用。I－κBα在受刺激初期表達(dá)量也立即下調(diào)而后上調(diào)，其上調(diào)時(shí)間點(diǎn)與NF－κB的上調(diào)時(shí)間點(diǎn)基本相同。結(jié)果表明，NF－κB被激活后，I－κBα也立即上調(diào)表達(dá)，且與NF－κB結(jié)合，使其失去活性。NF－κB/I－κB信號(hào)通路與RGV的關(guān)系可能極其復(fù)雜和緊密，RGV可利用NF－κB1和NF－κB2基因來(lái)增強(qiáng)其自身基因的表達(dá)，達(dá)到自身復(fù)制繁殖的目的。東北林蛙也需要依靠NF－κB1和NF－κB2基因調(diào)控下游多種免疫相關(guān)因子來(lái)防御RGV。

［1］ 張奇亞，肖楓，李正秋，等.從我國(guó)分離的3株蛙RGV與蛙病毒3型主要衣殼蛋白基因同源性的比較［J］.病毒學(xué)報(bào)，2002，18(1):83－85.

［2］ Sen R，Baltimore D.Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enhancer sequences［J］.Cell，1986，46(5):705 －716.

［3］ 楊淑靜，肖向紅，苗慧敏，等.蛙RGV刺激下東北林蛙皮膚活性肽的表達(dá)變化［C］//中國(guó)生理學(xué)會(huì).中國(guó)生理學(xué)會(huì)第23屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨生理學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要文集.西安:中國(guó)生理學(xué)會(huì)，2010:375.

［4］ Sambrook J，Russell D W.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［M］.3版.黃培堂，譯.北京:科學(xué)出版社，2002.

［5］ Kats L B，F(xiàn)errer R P.Alien predators and amphibian declines:Review of two decades of cience and the transition to conservation［J］.Diversity and Dlstributions，2003(9):99 －11.

［6］ Blaustein A R，Romansic J M，Kiesecker J M，et al.Ultraviolet radiation，toxic chemicals and amphibian population declines［J］.Diversity and Distributions，2003(9):123 －140.

［7］ Semlitseh R，Sehoek D M，Storfer S.Ecology and evolution of infectious disease［M］.Washington D C:Smithsonian Institution，2003:137－151.

［8］ Docherty D，Meteyer C，Wang J，et al.Diagnostic and molecular evaluation of three iridovirus-associated salamander mortality events［J］.J Wildl Dis，2003，39(3):556 －566.

［9］ Williams T，Barbosa-Solomieu V，Chinehar G D.A decade of advances in iridovirus research［J］.Shatkin A(eds)Advances in Virus Research，2005，65:173 －248.

［10］ Brunner J L，Schock D M，Davidson E W，et al.Intraspecific reservoirs:complex life history and the persistence of a lethal ranavirus［J］.Ecology，2004，85:560 － 566.

［11］ 謝簡(jiǎn)，李正秋，張奇亞，等.免疫組化法檢測(cè)美國(guó)青蛙組織中的蛙虹彩病毒［J］.水生生物學(xué)報(bào)，2002，26(5):438 －443.

［12］ Rutschmann S，Kilinc A，F(xiàn)errandon D.Cutting edge:the toll pathway is required for resistance to gram-positive bacterial infections in Drosophila［J］.The Journal of Immunology，2002，168(4):1542－1546.

［13］ 王冬冬.中國(guó)明對(duì)蝦核轉(zhuǎn)錄因子NF－кB家族基因在免疫調(diào)控中的功能研究［D］.青島:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所，2012.