姚芳，李志紅，閆喆，劉青娟，段惠軍，郄濤

高糖刺激下大鼠腎小球系膜細(xì)胞MMP-2，TIMP-2，MT1-MMP和CTGF的表達(dá)及意義

姚芳，李志紅，閆喆，劉青娟，段惠軍，郄濤

目的觀察高糖刺激的大鼠腎小球系膜細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)及其組織抑制物-2(TIMP-2)、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MT1-MMP)和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)的動(dòng)態(tài)變化以探討糖尿病腎病(DN)的發(fā)病機(jī)制。方法體外培養(yǎng)的大鼠HBZY-1腎小球系膜細(xì)胞分為低糖(5.5mmol/L葡萄糖)組、高糖(30mmol/L葡萄糖)組和滲透壓對(duì)照(5.5mmol/L葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇)組，24、48、72、96h后采用RT-PCR及Western blotting法分別檢測(cè)MMP-2、TIMP-2、MT1-MMP及CTGF的mRNA及蛋白表達(dá)情況，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)培養(yǎng)上清中Ⅳ型膠原的含量。結(jié)果Western blotting 結(jié)果顯示，與低糖組相比，高糖組MMP-2的表達(dá)在24h時(shí)略有升高，較低糖組增加10%±4%(P＜0.05)，至48h時(shí)則較低糖組減少42%±2%，其后隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)持續(xù)降低，至96h時(shí)較低糖組減少78%±2%；MT1-MMP表達(dá)在24h開始下降并隨時(shí)間呈下降趨勢(shì)，與低糖組相比較，在刺激的24h，高糖組MT1-MMP表達(dá)下降了29%±3%，隨后持續(xù)下降，至96h則下降了78%±9%(P＜0.01)。高糖組各時(shí)間點(diǎn)TIMP-2和CTGF表達(dá)均較低糖組增高，其中CTGF的表達(dá)在高糖刺激的24h即顯著增高，為低糖組的201%±24%，隨后持續(xù)增高，至培養(yǎng)96h為低糖組的484%±51%(P＜0.01)；TIMP-2的表達(dá)在24h時(shí)較低糖組增加55%±3%，且隨時(shí)間延長(zhǎng)呈增高趨勢(shì)(P＜0.01)。MMP-2、TIMP-2、MT1-MMP和CTGF的mRNA表達(dá)與相應(yīng)蛋白的表達(dá)趨勢(shì)基本一致。與低糖組相比，高糖組細(xì)胞上清中的Ⅳ型膠原于24h即有增加，且持續(xù)增高至96h(P＜0.05)。低糖組和滲透壓對(duì)照組組內(nèi)、組間的各指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論盡管高糖刺激早期可小幅誘導(dǎo)MMP-2的表達(dá)增強(qiáng)，但長(zhǎng)期高糖刺激則可抑制MMP-2和MT1-MMP的表達(dá)及活化，同時(shí)促進(jìn)系膜細(xì)胞TIMP-2和CTGF的表達(dá)。DN中腎小球細(xì)胞外基質(zhì)的積聚可能是由于上述細(xì)胞因子和蛋白酶引起細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡所致。

糖尿病腎??；腎小球系膜細(xì)胞；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-2；結(jié)締組織生長(zhǎng)因子；膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見而嚴(yán)重的并發(fā)癥，其發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)，已成為發(fā)達(dá)國(guó)家終末期腎病的首要原因[1]。DN的主要病理特征包括腎小球硬化及小管間質(zhì)纖維化。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的積聚是DN中腎小球硬化的基礎(chǔ)。近年來(lái)的研究顯示ECM降解能力下降在DN的發(fā)生、發(fā)展中起著更為重要的作用[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶(metalloproteinases，MMPs)家族中的MMP-2主要參與Ⅳ型膠原的降解，而后者是DN中腎小球基底膜增厚和系膜基質(zhì)堆積的主要成分，因此與DN的關(guān)系最為密切[3]。近年來(lái)有關(guān)MMP-2及其組織抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2)在DN中的作用存有較多爭(zhēng)議，關(guān)于MMP-2酶原的特異膜型激活劑——膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1(membrane type 1-matrix metalloproteinase，MT1-MMP)在DN中的表達(dá)及作用鮮見報(bào)道。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)是TGF-β1下游的重要效應(yīng)因子，因其具有較強(qiáng)的致纖維化作用[4]，且生物效應(yīng)較單一，已成為DN研究的熱點(diǎn)。目前有關(guān)CTGF在DN的ECM代謝障礙中的作用機(jī)制研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)以腎小球中功能最活躍的系膜細(xì)胞作為研究對(duì)象，動(dòng)態(tài)觀察高糖刺激對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠系膜細(xì)胞CTGF、MMP-2，TIMP-2和MT1-MMP及ECM表達(dá)的影響，以探討DN中ECM代謝障礙的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 大鼠HBZY-1腎小球系膜細(xì)胞株購(gòu)自武漢大學(xué)保藏中心。羊抗CTGF、TIMP-2、MT1-MMP多克隆抗體，小鼠抗MMP-2、β-actin單克隆抗體，ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒為Santa Cruz公司產(chǎn)品。RT-PCR試劑盒為Promega公司產(chǎn)品。Ⅳ型膠原ELISA試劑盒為Sigma公司產(chǎn)品。辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記兔抗羊IgG和羊抗小鼠IgG由北京中杉公司進(jìn)口分裝。聚偏二氟乙烯膜(PVDF)為 Milipore公司產(chǎn)品。溫度梯度PCR儀為德國(guó)Whatman Biometra公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 常規(guī)方法復(fù)蘇腎小球系膜細(xì)胞后，采用胰酶消化法傳代、培養(yǎng)。將細(xì)胞分為3組：低糖組(LG組，給予5.5mmol/L葡萄糖刺激)、滲透壓對(duì)照組(LG+M組，給予5.5mmol/L葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇)、高糖組(HG組，給予30mmol/L葡萄糖)。分別于刺激的24、48、72、96h收集細(xì)胞，提取蛋白及總RNA；同時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。

1.2.2 Western blotting檢測(cè) 細(xì)胞用冰PBS(0.01mol/L)洗2遍，加入細(xì)胞裂解液冰浴1h，4℃、14 000r/min離心15min，取上清，Lowry法測(cè)定蛋白濃度。每上樣孔加75μg總蛋白行12%SDSPAGE凝膠電泳；濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉37℃封閉1h；加封閉液稀釋的一抗(1:1000)于4℃過(guò)夜；洗膜后加HRP標(biāo)記的兔抗羊或羊抗小鼠IgG(1:5000)37℃孵育1.5h；洗膜后加化學(xué)發(fā)光劑ECL反應(yīng)1min，曝光、沖洗后掃描蛋白條帶。以β-actin為內(nèi)參照，采用美國(guó)UVP公司LabWork分析系統(tǒng)軟件對(duì)條帶進(jìn)行定量分析。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè) 采用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，用紫外可見分光光度儀測(cè)定其純度和含量。2μg總RNA和oligo(dT)15引物按Promega公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求加入試劑，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。取1μl cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。所用引物、退火溫度、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度及擴(kuò)增條件如下。CTGF：正義5'-CTCGCCTTGGTGCTCCTCCT-3'，反義5'-TGCGGTCCTTGGGCTCATC-3'，擴(kuò)增片段481bp，退火溫度60℃；MMP-2：正義5'-GGAGGCACGATTGGTCTG-3'，反義5'-TTGGTT TCCGCATGGTCT-3'，擴(kuò)增片段299bp，退火溫度55℃；MT1-MMP：正義5'-CCTCAAGTGGCAGCATA AT-3'，反義5'-AAGTTCTCGGTGTCCATCC-3'，擴(kuò)增片段459bp，退火溫度58℃；TIMP-2：正義5'-CCAAAGCAGTGAGCGAGAA-3'，反義5'-CATCCAG AGGCACTCATCC-3'，擴(kuò)增片段386bp，退火溫度57℃；18S rRNA：正義5'-ACACGGACAGGATTGAC AGA-3'，反義5'-GGACATCTAAGGGCATCACAG-3'，擴(kuò)增片段238bp，退火溫度56℃。所有引物均由上海生工生物公司合成，上述PCR反應(yīng)均為30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以18S rRNA為內(nèi)參照，在凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司)下進(jìn)行定量分析。

1.2.4 ELISA檢測(cè) 采用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中Ⅳ型膠原的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以表示，各組樣本方差齊，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Western blotting檢測(cè)結(jié)果 與低糖組相比，高糖組MMP-2的表達(dá)在24h時(shí)略有升高，較低糖組增加10%±4%(P＜0.05)，至48h時(shí)則較低糖組減少42%±2%，其后隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)持續(xù)降低，至96h時(shí)較低糖組減少78%±2%；MT1-MMP表達(dá)在24h開始下降并隨時(shí)間呈下降趨勢(shì)，高糖組與低糖組比較，在刺激的24h，MT1-MMP表達(dá)下降了29%±3%，隨后持續(xù)下降，至96h下降了78%±9%(P＜0.01)。高糖組各時(shí)間點(diǎn)TIMP-2和CTGF表達(dá)均較低糖組上調(diào)，其中CTGF的表達(dá)在高糖刺激的24h即顯著上調(diào)，為低糖組的201%±24%，隨后持續(xù)增高，培養(yǎng)至96h為低糖組的484%±51%(P＜0.01)；TIMP-2的表達(dá)在24h時(shí)較低糖組增加55%±3%，且隨時(shí)間呈增高趨勢(shì)(P＜0.01)。低糖組和滲透壓對(duì)照組組內(nèi)、組間的各指標(biāo)均無(wú)顯著性差異(圖1－4)。

圖1 系膜細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.1 Expression of MMP-2 protein in cultured GMCs

圖2 系膜細(xì)胞MT1-MMP蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.2 Expression of MT1-MMP protein in cultured GMCs

圖3 系膜細(xì)胞TIMP-2蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.3 Expression of TIMP-2 protein in cultured GMCs

圖4 系膜細(xì)胞CTGF蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.4 Expression of CTGF protein in cultured GMCs

2.2 半定量RT-PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá) MMP-2、TIMP-2、MT1-MMP和CTGF的mRNA表達(dá)與各自蛋白的表達(dá)趨勢(shì)基本一致。即CTGF mRNA和TIMP-2 mRNA在低糖組有少量表達(dá)，在高糖組各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)上調(diào)，且隨時(shí)間呈增高趨勢(shì)，而MT1-MMP mRNA在低常糖組有較高表達(dá)，在高糖組各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)下調(diào)且隨時(shí)間呈下降趨勢(shì)(P＜0.01)。高糖組24h的MMP-2 mRNA表達(dá)略有增加，較低糖組增加9%±2%(P＜0.05)，其后48～96h則低于低糖組，且隨時(shí)間持續(xù)降低(圖5－8)。低糖組和滲透壓對(duì)照組組內(nèi)、組間的各指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5 系膜細(xì)胞MMP-2 mRNA表達(dá)結(jié)果Fig.5 Expression of MMP-2 mRNA in cultured GMCs

圖6 系膜細(xì)胞MT1-MMP mRNA表達(dá)結(jié)果Fig.6 Expression of MT1-MMP mRNA in cultured GMCs

圖7 系膜細(xì)胞TIMP-2 mRNA表達(dá)結(jié)果Fig.7 Expression of TIMP-2 mRNA in cultured GMCs

圖8 系膜細(xì)胞CTGF mRNA表達(dá)結(jié)果Fig.8 Expression of CTGF mRNA in cultured GMCs

2.3 細(xì)胞上清液檢測(cè)結(jié)果 與低糖組相比，高糖組細(xì)胞上清中的Ⅳ型膠原24h時(shí)即有增加，且持續(xù)增高至96h，低糖組和滲透壓對(duì)照組組內(nèi)、組間的Ⅳ型膠原含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表1)。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)系膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Ⅳ型膠原濃度(±s，μg/L)Tab.1 Concentration of collagen Ⅳ in the supernatants of GMCs at different time points±s, μg/L)

表1 不同時(shí)間點(diǎn)系膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Ⅳ型膠原濃度(±s，μg/L)Tab.1 Concentration of collagen Ⅳ in the supernatants of GMCs at different time points±s, μg/L)

(1)P＜0.01 compared with LG group and LG+M group

Group24h48h72h96h LG1.11±0.171.17±0.151.21±0.141.19±0.13 LG+M1.05±0.141.01±0.111.11±0.181.07±0.16 HG2.01±0.24(1)3.49±0.37(1)7.12±0.81(1)12.32±1.98(1)

3 討 論

腎小球系膜增生和擴(kuò)張是DN的重要標(biāo)志，并且系膜擴(kuò)張程度與DN患者的腎功能和臨床癥狀密切相關(guān)。系膜擴(kuò)張的主要原因是系膜基質(zhì)合成、降解失衡。腎小球系膜細(xì)胞是腎小球中功能最活躍的細(xì)胞，具有合成細(xì)胞外基質(zhì)、分泌細(xì)胞因子的功能，并能吞噬和清除異物，對(duì)于維持腎臟的正常組織結(jié)構(gòu)和生理功能發(fā)揮著重要作用。早前一些體外研究顯示，高糖可誘導(dǎo)多種ECM成分的基因表達(dá)和蛋白合成[5-6]。近年來(lái)一些體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)都提示DN中ECM降解過(guò)程受到抑制，且這種抑制現(xiàn)象與系膜細(xì)胞合成和分泌MMPs的功能異常有關(guān)[7-9]。多數(shù)體外實(shí)驗(yàn)顯示高糖、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、糖基化終產(chǎn)物(AGEs)和TGF-β1等刺激均可抑制系膜細(xì)胞MMP-9的表達(dá)和活性[10-13]。但是上述刺激因素對(duì)系膜細(xì)胞MMP-2及其相關(guān)抑制因子和激活因子的作用如何則報(bào)道不一，甚至相悖[9-15]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)動(dòng)態(tài)觀察高糖刺激對(duì)系膜細(xì)胞MMP-2的表達(dá)與活性的影響，發(fā)現(xiàn)高糖刺激對(duì)MMP-2的表達(dá)和活性的影響隨刺激時(shí)間的不同而變化。高糖刺激24h，系膜細(xì)胞MMP-2的基因表達(dá)、蛋白合成與酶活性均有小幅度增高，隨后從48h至96h MMP-2在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后翻譯和活化三個(gè)水平上均持續(xù)下降。與此同時(shí)系膜細(xì)胞分泌Ⅳ型膠原的量從24h開始增加，且持續(xù)增高至96h。這種在高糖刺激早期MMP-2的表達(dá)與活性上調(diào)現(xiàn)象的調(diào)節(jié)機(jī)制目前還不清楚，可能與高糖刺激系膜細(xì)胞ECM合成增多引起反饋性MMP-2表達(dá)上調(diào)有關(guān)[16]，也可能與DN早期腎小球基底膜損傷和ECM重構(gòu)有關(guān)[17]。這種系膜細(xì)胞MMP-2與Ⅳ型膠原變化大致反向平行的現(xiàn)象提示系膜基質(zhì)降解減少可能是導(dǎo)致DN中腎小球系膜擴(kuò)張和硬化的原因之一。

本實(shí)驗(yàn)還同時(shí)觀察了高糖刺激對(duì)系膜細(xì)胞MT1-MMP、TIMP-2表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)在低糖培養(yǎng)下腎小球系膜細(xì)胞有一定水平的MT1-MMP的表達(dá)，高糖刺激后，從24h開始MT1-MMP表達(dá)降低，并隨刺激時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)降低。TIMP-2的變化則與MT1-MMP相反。從高糖刺激24h開始系膜細(xì)胞表達(dá)TIMP-2明顯升高，并隨刺激時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)增高。MT1-MMP和TIMP-2 均參與MMP-2轉(zhuǎn)錄后的活性調(diào)節(jié)。MT1-MMP是MMP-2的特異膜型激活劑，主要表達(dá)于系膜細(xì)胞的胞膜部位，同時(shí)在胞質(zhì)中也存在一定量可溶形式的MT1-MMP[18]。TIMP-2是MMP-2的特異組織抑制物，通過(guò)與MMP-2特異結(jié)合而阻止其對(duì)底物的降解作用。MT1-MMP和TIMP-2在系膜細(xì)胞的變化趨勢(shì)提示二者的異常變化可能是DN中MMP-2活性下降的原因之一。

目前研究普遍認(rèn)為CTGF是TGF-β1最重要的下游效應(yīng)因子[19]，具有調(diào)節(jié)ECM代謝、促細(xì)胞增殖、遷移和誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用[20-21]。有體外研究顯示CTGF除具有促進(jìn)ECM合成的作用外，還具有抑制基質(zhì)成分降解的作用，這一作用部分通過(guò)抑制MMP-2的活化而實(shí)現(xiàn)[15]。本實(shí)驗(yàn)在觀察高糖對(duì)系膜細(xì)胞MMP-2/TIMP-2和MT1-MMP的影響的同時(shí)，還檢測(cè)了系膜細(xì)胞中CTGF的表達(dá)變化。結(jié)果顯示高糖刺激使CTGF表達(dá)明顯增高，并且同系膜細(xì)胞分泌Ⅳ型膠原的變化趨勢(shì)相一致，與MMP-2的變化大致相反。此結(jié)果提示CTGF可能參與調(diào)節(jié)DN中ECM的降解過(guò)程。

總之，正常情況下系膜細(xì)胞、細(xì)胞因子、MMPs、MT1-MMP、TIMPs和ECM之間相互制約，使ECM 的合成和降解處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，但當(dāng)高糖存在時(shí)，這種正常的制約和平衡遭到破壞，最終導(dǎo)致ECM合成增加和(或)降解減少，引起系膜細(xì)胞ECM堆積，這是糖尿病腎病的病理基礎(chǔ)。

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Expression of MMP-2, TIMP-2, CTGF and MT1-MMP in rat glomerular mesangial cells stimulated by high-glucose and its significance

YAO Fang1, LI Zhi-hong2, YAN Zhe1, LIU Qing-juan1, DUAN Hui-jun1, QIE Tao21Department of Pathology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China
2Department of Endocrinology, First Central Hospital of Baoding City, Baoding, Hebei 071000, China
This work was supported by the Youth Foundation of Education Department of Hebei Province (2010150)

ObjectiveTo observe the dynamic changes of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (TIMP-2), membrane-type 1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP) and connective tissue growth factor (CTGF) expression in high glucose-stimulated glomerular mesangial cells (GMCs) in rats, and investigate the mechanism of the pathogenesis of diabetic nephropathy.MethodsRat HBZY-1 GMCs were cultured and divided into 3 groups: low concentration (5.5mmol/L) D-glucose (LG) group, high concentration (30mmol/L) D-glucose (HG) group and 24.5mmol/L mannitol plus 5.5mmol/L D-glucose (LG+M) group (served as osmotic pressure control). The mRNA and protein expressions of MMP-2, TIMP-2, MT1-MMP and CTGF were detected with semi-quantitative RT-PCR and Western blotting, and the secreted collagen Ⅳin supernatants of the GMCs was detected by ELISA after cultured for 24, 48, 72 and 96h.ResultsCompared with LG group, after exposure to high glucose for 24h, MMP-2 expression was slightly increased (increased by 10%±4%) in GMCs in HG group (P＜0.05). But when the exposure time last from 48h to 96h, the expression of MMP-2 was decreased by 42%±2% to 78%±2%(P＜0.01). Compared with LG group, high-glucose incubation resulted in down-regulation of MT1-MMP (decreased by 29%±3% at 24h to 78%±9% at 96h,P＜0.01) whereas up-regulation of TIMP-2 (increased by 55%±3% at 24h,P＜0.01) and CTGF (increased by 201%±24% at 24h to 484%±51% at 96h,P＜0.01). RT-PCR revealed consistent dynamic changes of MMP-2, TIMP-2, MT1-MMP and CTGF with their protein changes listed above. Compared with LG group, the secreted collagen Ⅳ in supernatants of HG group was increased by 201%±24% at 24h to 1232%±198% at 96h (P＜0.01). There was no significant difference of above indexes between LG group and LG+M group.ConclusionsHigh glucose may induce and activate MMP-2 transiently, but can inhibit the expression of MMP-2 and MT1-MMP for a long term whereas induce the expressions of TIMP-2 and CTGF in GMCs. MMP-2, TIMP-2, MT1-MMP and CTGF may contribute to the metabolism imbalance of extracellular matrix then induce the accumulation of extracellular matrix in diabetic nephropathy.

diabetic nephropathy; glomerular mesangial cells; metalloproteinase-2; tissue inhibitor of metalloproteinase-2; connective tissue growth factor; membrane-type 1 matrix metalloproteinase

R587.1

A

0577-7402(2013)10-0811-07

10.11855/j.issn.0577-7402.2013.10.006

2013-05-14；

2013-07-15)

(責(zé)任編輯：張小利)

河北省教育廳青年基金(2010150)

姚芳，醫(yī)學(xué)博士。主要從事糖尿病腎病基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

050017 石家莊 河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室(姚芳、閆喆、劉青娟、段惠軍)；071000 河北保定 保定市第一中心醫(yī)院內(nèi)分泌科(李志紅、郄濤)