曾暉，朱明亮，郭遠波，閆國防

miR-200b靶向調(diào)控PKCα表達對膠質(zhì)瘤細胞增殖和侵襲能力的影響

曾暉，朱明亮，郭遠波，閆國防

目的觀察miR-200b能否通過靶向調(diào)控蛋白激酶Cα(PKCα)的表達而抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖及侵襲能力，探討miR-200b的抑瘤分子機制。方法構(gòu)建PKCα 3'-UTR-熒光素酶報告載體，通過熒光素酶活性檢測觀察miR-200b對PKCα 3'-UTR-熒光素酶活性的影響。將miR-200b 模擬物轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞U87，采用Western blotting檢測PKCα表達水平。將PKCα siRNA轉(zhuǎn)染U87細胞，通過MTS法和Transwell侵襲實驗觀察細胞生長和侵襲能力的變化。結(jié)果雙熒光素酶檢測顯示，miR-200b能特異性地與PKCα mRNA的3'-UTR結(jié)合，抑制其熒光素酶活性。過表達miR-200b的U87細胞PKCα mRNA及蛋白表達水平降低。siRNA干擾PKCα表達可抑制U87細胞的增殖和侵襲能力。結(jié)論miR-200b可通過靶向調(diào)控PKCα的表達而抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖和侵襲能力。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤；微RNAs；蛋白激酶Cα；細胞增殖；腫瘤浸潤

近年來，miRNA已成為分子生物學研究的熱點。人類miRNA通過調(diào)控其靶基因的表達及相關(guān)信號通路，具有類似于癌基因或抑癌基因的功能，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中發(fā)揮重要作用[1]。研究表明，miR-200在多種腫瘤組織和細胞中表達下調(diào)[2-3]，其中miR-200b可通過靶向Ras鳥苷酸結(jié)合蛋白超家族新成員(RND3)，阻滯宮頸癌Hela細胞周期的進展[4]。下調(diào)miR-200b表達可促進支氣管上皮細胞的上皮間葉轉(zhuǎn)化(EMT)及腫瘤形成[5]，miR-200b在EB病毒感染的胃癌組織及胃癌細胞系中表達均下降。miR-200b可通過上調(diào)ZEB1/ZEB2的表達，促進胃癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移[6]，也可通過調(diào)控其靶基因ZEB2抑制胃癌細胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[7]。但miR-200b在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用的分子機制尚不清楚。本研究通過分子生物學方法觀察miR-200b靶向調(diào)控蛋白激酶Cα(PKCα)表達對膠質(zhì)瘤細胞增殖和侵襲能力的影響，旨在進一步了解miR-200b的抑瘤機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 惡性膠質(zhì)瘤細胞U87為第四軍醫(yī)大學神經(jīng)科學研究所惠贈，培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM中。T4DNA連接酶、SpeⅠ和Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶為大連寶生物公司產(chǎn)品。miR-200b 模擬物為Ambion公司產(chǎn)品。PKCα siRNA由Invitrogen公司合成，序列為5'-GGGATCGAACAACAAGGAA-3'。雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自Promega公司。PKCα單克隆抗體和GAPDH抗體購自Santa Cruz公司。DMEM培養(yǎng)基為Hyclone公司產(chǎn)品。MTS細胞增殖/毒性檢測試劑盒購自美國Sigma公司。鋪有基質(zhì)膠的Transwell侵襲小室購自BD Biosciences公司。

1.2 野生型PKCα 3'-UTR-熒光素酶報告載體的構(gòu)建 通過Targetscan 6.2軟件預測出miR-200b可能與PKCα mRNA的3'-UTR片段1319～1325bp結(jié)合。根據(jù)PKCα 3'端非翻譯區(qū)(3'-UTR)序列設(shè)計末端帶SpeⅠ和Hind Ⅲ酶切位點的特異性引物，其序列為正向5'-AGAACTAGTGAGTGTTGGGTGAATCTG-3'，反向5'-GTCAAGCTTCTATCACGTAAACTAGCC-3'。將PCR產(chǎn)物及pMIR熒光報告載體分別用SpeⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后純化，連接，轉(zhuǎn)化，鑒定。構(gòu)建野生型PKCα 3'-UTR-熒光素酶載體，命名為PKCα-Wt。突變型PKCα 3'-UTR-熒光素酶報告載體構(gòu)建由Invitrogen公司合成，命名為PKCα-Mt。

1.3 熒光素酶活性檢測 將熒光素酶報告載體與miR-200b模擬物(處理組)或無關(guān)序列(對照組)共轉(zhuǎn)染U87細胞，以轉(zhuǎn)染pRL-TK的細胞作為內(nèi)參照，轉(zhuǎn)染36h后收獲細胞，按Promega公司雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書采用單光子檢測儀檢測細胞熒光素酶活性。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值×100%。

1.4 MTS法檢測細胞增殖活性 取轉(zhuǎn)染miR-200b模擬物或si-PKCα后的U87細胞，消化后接種細胞于96孔板中，每孔1×103個細胞，miR-200b模擬物組、si-PKCα組以及對照組各設(shè)6個平行復孔，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在未接種細胞的孔中加入DMEM培養(yǎng)基作為調(diào)零孔。分別于培養(yǎng)24、48、72、96h后進行檢測。檢測時每孔加20μl MTS試劑，37℃孵育2h，用酶標儀測定492nm處的吸光度值。實驗重復3次。

1.5 Transwell侵襲實驗 先將鋪有基質(zhì)膠的Transwell板預熱至37℃。消化PKCα siRNA 或miR-200b模擬物轉(zhuǎn)染的U87細胞，用無血清培基洗滌2次，再用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度為1×105/ml。在Transwell下室加入800μl含15% FCS的培養(yǎng)基，上室加入250μl細胞懸液，37℃培養(yǎng)48h。取出Transwell小室，擦掉靠上室側(cè)膜的細胞，PBS清洗，14%甲醛溶液固定10min，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察、照相，隨機選取5個高倍視野(×100)進行細胞計數(shù)，并計算平均值。實驗重復3次。

1.6 Western blotting檢測miR-200b對PKCα蛋白表達的影響 將miR-200b 模擬物或si-PKCα轉(zhuǎn)染U87細胞，48h后提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取等量樣本，行SDS-PAGE凝膠電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，1%BSA封閉后，加入PKCα抗體或GAPDH抗體，4℃過夜。TBST洗膜10min，加入二抗室溫孵育1h，TBST洗膜10min，加入ECL發(fā)光劑，X線曝光、顯影、定影。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)結(jié)果以表示，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-200b對PKCα mRNA的3'-UTR熒光素酶活性的影響 miR-200b模擬物或無關(guān)序列與pPKCα-Wt、PKCα-Mt共轉(zhuǎn)染到U87細胞中，以轉(zhuǎn)染pRL-TK的細胞作為內(nèi)參照。雙熒光酶活性檢測結(jié)果顯示，miR-200b模擬物可明顯抑制野生型PKCα-Wt報告載體的熒光素酶活性(為內(nèi)參照的58.7%，P＜0.05)，而miR-200b 模擬物對突變型PKCα-Mt載體的熒光素酶活性無明顯抑制作用(為內(nèi)參照的99.6%，P＞0.05)，表明miR-200b能特異性地與PKCα mRNA的3'-UTR結(jié)合。

2.2 miR-200b對PKCα蛋白表達的影響 miR-200b模擬物轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤U87細胞48h后，以轉(zhuǎn)染無關(guān)序列的細胞為陰性對照，轉(zhuǎn)染PKCα siRNA的細胞為陽性對照。Western blotting檢測顯示，轉(zhuǎn)染miR-200b后U87細胞PKCα蛋白表達與對照組比較明顯降低(圖1)，表明miR-200b能靶向調(diào)控PKCα的表達。

圖1 miR-200b對U87細胞PKCα蛋白表達的影響(Western blotting)Fig. 1 Effect of miR-200b on the expression of PKCα protein in U87 cells (Western blotting)

2.3 PKCα siRNA對膠質(zhì)瘤U87細胞增殖和侵襲能力的影響 將PKCα siRNA轉(zhuǎn)染到U87細胞中，MTS法檢測顯示，細胞增殖速度自48h開始明顯減慢，與無關(guān)序列對照比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖2)。Transwell侵襲實驗顯示，轉(zhuǎn)染PKCα siRNA后的U87細胞侵襲能力(侵襲細胞數(shù)為69±12)明顯降低，與無關(guān)序列對照(侵襲細胞數(shù)為113±26)比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。表明PKCα siRNA可抑制膠質(zhì)瘤U87細胞的增殖和侵襲能力。

圖2 PKCα siRNA對膠質(zhì)瘤細胞增殖能力的影響Fig. 2 Effect of PKCα siRNA on the proliferation of glioma cells

3 討 論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤也稱膠質(zhì)細胞瘤，簡稱膠質(zhì)瘤，是發(fā)生于神經(jīng)外胚層的腫瘤，起源于神經(jīng)間質(zhì)細胞和神經(jīng)實質(zhì)細胞，占原發(fā)性腦腫瘤的50%～60%。目前膠質(zhì)瘤的臨床療效欠佳，尤其是多形性膠質(zhì)母細胞瘤的預后很差。因此尋找神經(jīng)膠質(zhì)瘤新的治療靶點與治療方法是臨床上亟待解決的問題。

MicroRNA是一類內(nèi)源性的具有調(diào)節(jié)作用的非編碼RNA。近年來研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與多種調(diào)節(jié)途徑，包括細胞增殖、凋亡、分化、發(fā)育和代謝等[8]。蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是存在于細胞質(zhì)內(nèi)，由鈣活化的磷脂依賴性絲/蘇氨酸蛋白激酶家族，廣泛參與調(diào)節(jié)多種生物學事件，如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、免疫介導、學習與記憶、受體脫敏、細胞代謝、細胞生長、分化、增殖、癌變及細胞凋亡等[9]，迄今已從不同種屬的生物中分離、純化出12種不同的PKC亞型。PKCα與腫瘤基因的不穩(wěn)定性和腫瘤細胞的增殖、抗凋亡、侵襲、藥物抵抗有關(guān)[10]，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。本研究結(jié)果證實PKCα是miR-200b調(diào)控的直接靶基因，并通過siRNA干擾實驗證實下調(diào)PKCα表達可抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖和侵襲能力，PKCα能部分模擬miR-200b的抑瘤功能，表明miR-200b可通過靶向調(diào)控PKCα的表達抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖和侵襲能力，進一步揭示了miR-200b的抑瘤分子機制。

綜上所述，miRNA作為癌基因或抑癌基因功能的發(fā)現(xiàn)為腫瘤發(fā)生機制的研究提供了新思路，也為腫瘤的預防、診斷、預后判斷提供了新策略，繼續(xù)深入研究miR-200b參與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制，可為膠質(zhì)瘤的防治提供理論依據(jù)及實驗基礎(chǔ)。

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Influence of target regulation of PKCα by miR-200b on proliferation and invasion of glioma cells

ZENG Hui, ZHU Ming-liang*, GUO Yuan-bo, YAN Guo-fang
Department of Neurosurgery, 169 Hospital of PLA, Hengyang, Hunan 421001, China
*

, E-mail: mingliang915@yahoo.com.cn

ObjectiveTo survey whether miR-200b suppresses proliferation and invasiveness of glioma cells by targeted regulation of protein kinase Cα (PKCα) expression, and to investigate the molecular mechanism of antitumor effect of miR-200b.MethodsPKCα 3'-UTR-luciferase vector was constructed and dual-luciferase reporter gene assay was employed to examine the effect of miR-200b on PKCα 3'-UTR-luciferase activity. U87 cells were transfected with miR-200b mimics, and the expression of PKCα protein was determined by Western blotting. U87 cells were transfected with PKCα siRNA, and then the changes in cellular proliferation and invasiveness were observed by MTS method and Transwell assay, respectively. ResultsDual-luciferase reporter gene assay showed that miR-200b could bind to 3'-UTR of PKCα mRNA specifically and inhibited the luciferase activity. Expression of PKCα mRNA and protein decreased significantly in U87 cells overexpressing miR-200b. siRNA-mediated down-regulation of PKCα could suppress the potentials of proliferation and invasiveness of U87 cells.ConclusionmiR-200b could inhibit the proliferation and invasion of glioma cellsviatargeted regulation of PKCα expression.

glioma; microRNAs; protein kinase C-alpha; cell proliferation; neoplasm invasiveness

R739.41

A

0577-7402(2013)10-0834-03

10.11855/j.issn.0577-7402.2013.10.011

2013-03-10；

2013-07-16)

(責任編輯：胡全兵)

曾暉，主治醫(yī)師。主要從事神經(jīng)外科疾病的診斷與治療工作

421001 湖南衡陽 解放軍169醫(yī)院神經(jīng)外科(曾暉、朱明亮、郭遠波、閆國防)

朱明亮，E-mail：mingliang915@yahoo.com.cn