陳世通，白建波，李夢杰，李榮春

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌研究所，云南 昆明 650201)

單孢雜交是香菇Lentinula edodes(Berk.)Pegler新品種選育最常用的育種方法[1]。目前我國香菇生產(chǎn)上廣泛使用的品種大多來自國外，缺乏自主知識產(chǎn)權(quán)的品種，而且由于栽培年限普遍較長，退化現(xiàn)象嚴重，因此香菇新品種選育成為人們十分關(guān)注的課題。筆者以“大山18”和野生香菇“11－1”作為親本進行單孢雜交育種，以期選育出優(yōu)良新品種。

ISSR是一種基于基因組簡單重復(fù)序列的DNA標(biāo)記技術(shù)[2]。本研究用ISSR標(biāo)記對香菇單孢雜交后代進行了鑒定，探討了在雜合子鑒定中應(yīng)用ISSR標(biāo)記的可行性，現(xiàn)將試驗結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

親本為香菇栽培品種“大山18”、云南野生香菇“11－1”，均由云南大山合公司提供。

1.2 培養(yǎng)基

單孢分離和配對雜交培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基；菌絲液體培養(yǎng)基：液體PDA培養(yǎng)基。

1.3 親本選擇

“大山18”是云南大山合公司廣泛栽培品種，蓋大肉厚，較耐高溫，產(chǎn)量高。最大不足是菌柄過長，菌絲抗污染能力不強?！?1－1”是采自云南龍陵的野生香菇菌株，經(jīng)馴化栽培表明，該菌株的菌柄短，并且菌絲抗污染能力較強。以優(yōu)勢性狀互補的“大山18”和“11－1”作為親本，由于在生態(tài)類型上有較大的遺傳差異，后代出現(xiàn)雜種優(yōu)勢的機會更大。

1.4 單孢分離

[3]、 [4]。

1.5 配對雜交

將單核菌株隨機配對雜交，培養(yǎng)至菌絲交接在一起時，挑取融合菌絲鏡檢，將有鎖狀聯(lián)合者擴大培養(yǎng)。

1.6 拮抗試驗

在平板內(nèi)用三點接種法接種親本“大山18”、“11-1”和雜交菌株，觀察各菌株之間的拮抗反應(yīng)。

1.7 雜交菌株的ISSR鑒定

1.7.1 DNA的提取

將雜交菌株和親本菌株分別接種于液體培養(yǎng)基內(nèi)，15 d后過濾收集菌絲并提取DNA。

1.7.2 ISSR引物篩選

本試驗參照參考文獻[5]選用了12個引物，對兩親本DNA進行PCR擴增。供試的ISSR引物及其序列見表1。

表1 供試的ISSR引物及其序列

PCR反應(yīng)體系 （20μL）見表2。

表2 PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)程序見表3。

表3 PCR反應(yīng)程序

將擴增產(chǎn)物進行電泳，之后在紫外凝膠成像系統(tǒng)上觀察，并從中篩選出條帶清晰且含有2個親本特異性條帶的引物。

1.7.3 雜交菌株的鑒定

利用篩選出的引物對雜交菌株和親本單核菌株進行ISSR-PCR擴增。PCR的反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù)見表2和表3。擴增反應(yīng)結(jié)束后進行電泳，之后在紫外凝膠成像系統(tǒng)上拍照并記錄擴增圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 配對雜交結(jié)果

雜交成功的菌落交界處會出現(xiàn)白色絨毛狀的異樣菌絲，如圖1單孢雜交配對反應(yīng)中箭頭1所示。本試驗共獲得84個雜交菌株，分別編號DO-i(i=1、2、3……84)。

2.2 拮抗試驗

將84個雜交菌株與兩親本在平板上做拮抗試驗，有45個雜交菌株與兩親本出現(xiàn)很明顯的拮抗線，說明這45個菌株與兩親本有了質(zhì)的不同，是雜交所得的新菌株（如圖2箭頭1和2所示）。而其它39個菌株與親本“大山18”的菌絲可以相互交叉，無拮抗反應(yīng)（如圖2箭頭3所示）。

2.3 ISSR分子鑒定

DNA分子標(biāo)記對雜交菌株的鑒定是從遺傳物質(zhì)的不同來源進行鑒定的。雜交菌株應(yīng)同時擁有兩親本的特異條帶，雜交種與雙親的條帶在凝膠中對應(yīng)于同一水平線上[6]。

引物篩選結(jié)果表明，ISSR6引物能擴增出兩親本的2條特異條帶（圖4箭頭1所指條帶為“大山18”特有，箭頭2所指為“11-1”特有），所以選擇此引物對雜交菌株進行鑒定。其它11個引物都擴增不出兩親本的特異條帶。

ISSR分析表明有39個菌株只有親本“大山18”的特異條帶（如圖3中的DO5所示），結(jié)合拮抗試驗可以斷定，這39個菌株并不是兩親本的雜合子。剩下的45個菌株有兩親本的特異條帶，從分子層面證明這45個菌株是兩親本真正的雜合子。

3 討論

筆者成功用ISSR標(biāo)記從大量雜交后代中鑒別出真雜合子，這在國內(nèi)外尚無相關(guān)報道，具有一定的原創(chuàng)性。運用ISSR技術(shù)能在菌絲體階段鑒別出真雜合子，相比鑒定周期長的形態(tài)學(xué)標(biāo)記，加速了育種進程。將ISSR標(biāo)記開發(fā)成一種穩(wěn)定可靠的分子標(biāo)記，對香菇遺傳育種研究具有重大意義。

在后繼的研究中，將對鑒定出的雜交菌株進行栽培出菇，摸清雜交菌株的溫型和菌齡，對提高它們的綜合性狀有重要意義。

[參考文獻]

[1]王卓仁，劉啟燕，肖揚，等.香菇單孢雜交子代群體灰色關(guān)聯(lián)度和ISSR分析[J].菌物學(xué)報，2010，29(2)：267-272.

[2]Zietkiewicz E,Rafalski A,Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat(SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics，1994，20 (2)：176-183.

[3]劉宇，王守現(xiàn)，耿小麗，等.杏鮑菇14號雜交菌株選育研究[J].中國食用菌，2011，30 (6)：15-17.

[4]李冠喜，華國棟，王多明，等.采用同核體單孢雜交育種技術(shù)選育雙孢蘑菇[J].食用菌學(xué)報，2011，18 (3)：17-21.

[5]劉勇.四川攀西野生香菇遺傳多樣性與生理特性分析[D].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2008.

[6]傅俊生，朱堅，謝寶貴，等.草菇雜交菌株2628的鑒定與品比試驗[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2010，26 (14)：48-53.