許曉燕，余夢瑤，江 南，魏 巍，羅 霞

（四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041）

毛木耳Auricularia polytricha(Mont)Sacl.是我國主栽食 (藥)用菌品種之一，具有栽培簡便、產(chǎn)量大等優(yōu)點。毛木耳中富含毛木耳多糖（Auricularia polytricha Polysaccharide,APP），據(jù)研究表明APP具有提高免疫[1]、抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、抗凝血[4]、抗血栓[5]、降血脂[4]以及保護(hù)機(jī)體細(xì)胞[6]等作用。

采用熱水為媒介，以浸提溫度、浸提時間、料水比和浸提次數(shù)為主要因素進(jìn)行正交試驗，確定毛木耳多糖最佳提取工藝，為毛木耳多糖的開發(fā)及利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

毛木耳，購自四川省德陽市，洗凈烘干后備用。

濃硫酸、苯酚、葡萄糖等試劑均為分析純。

昆明種標(biāo)準(zhǔn)小鼠，體重18 g～22 g，雌雄各半，SPF級，合格證號：SCXK（川）2008-19。

紫外分光光度計，北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司TU-1800；電子天平，METTLER TOLEDO AL104；純水機(jī)，Millipore，Milli-Q；移液器，F(xiàn)innpipette；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海實驗儀器廠有限公司，101A-2型；電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設(shè)備有限公司，DK-80型；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用硫酸-苯酚比色法[7]測定多糖含量。分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（40 μg·mL-1）0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，各以蒸餾水補充至1.0 mL，然后加入0.5 mL的苯酚溶液（6.0%），再迅速滴加2.5 mL的濃硫酸（每個濃度做3個平行）。另取2個試管各加1.0 mL蒸餾水同上操作，為空白。于40℃水浴中恒溫0.5 h，取出，冷卻15 min后，于490 nm處測其吸光度值。以葡萄糖濃度為縱坐標(biāo)，OD490值為橫坐標(biāo)作圖，繪制多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程為Y=142.08X-0.0596，R2=0.9923。

1.2.2 提取方法

準(zhǔn)確稱取適量毛木耳子實體樣品，按一定比例加入蒸餾水，于恒溫水浴中浸提，然后離心分離，沉淀用同樣的方法浸提，合并上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將上清液濃縮到適當(dāng)體積后，緩慢加入4倍體積的95%乙醇，4℃低溫靜置24 h，4500 r·min-1離心30 min，收集沉淀，用95%乙醇洗滌得粗多糖。采用硫酸-苯酚比色法測定多糖含量，計算得率。

1.2.3 單因素試驗

料液比的選擇：精密稱取10.00 g干燥的毛木耳子實體粉末（過20目篩）5份，按料液比（g·mL-1）1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，在 100℃條件下浸提 4 h，共提取 3次，每份平行做3次。然后用硫酸-苯酚法測定多糖含量，比較不同料液比條件下的多糖提取率[8]。

浸提溫度的選擇：分別稱取10.00 g毛木耳子實體粉末5份，按上述試驗確定的料液比加入蒸餾水，選擇溫度60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，浸提2 h，共提取3次，每份平行做3次。然后用硫酸-苯酚法測定多糖含量，比較不同浸提溫度條件下的多糖提取率。

浸提時間的選擇：分別稱取10.00 g毛木耳子實體粉末5份，按照上述確定的料液比和浸提溫度，選擇浸提時間1 h、2 h、3 h、4 h和5 h，每份平行做3次，比較不同浸提時間條件下的多糖提取率[9]。

浸提次數(shù)的選擇：分別稱取10.00 g毛木耳子實體粉末5份，按上述確定的料液比、浸提溫度和浸提時間，選擇浸提次數(shù)1次、2次、3次、4次和5次，每份平行做3次，比較不同浸提次數(shù)條件下的多糖提取率。

1.2.4 正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗進(jìn)行提取工藝的優(yōu)化[10]。以浸提溫度（A）、浸提時間（B）、料水比（C）和浸提次數(shù)（D）為主要因素，每個組合設(shè)3個重復(fù)，取平均值作為多糖得率。

1.2.5 正交試驗驗證試驗

重復(fù)驗證正交試驗得到的多糖提取試驗最佳組合。

1.2.6 小鼠血清溶血素抗體生成試驗

小鼠30只，隨機(jī)分為3組，每組10只，給藥組經(jīng)口給予毛木耳多糖100 mg·kg-1，空白組和模型組給予同等體積的蒸餾水，連續(xù)給藥30 d。在首次給藥后第23天，每只小鼠腹腔注射5%雞紅細(xì)胞溶液0.2 mL。在第23天、第25天、第27天，除正常組腹腔注射生理鹽水外，其余小鼠均腹腔注射CY 20 mg·kg-1。末次給藥30 min后，從小鼠眼后靜脈叢取血20μL，加入盛有1 mL生理鹽水的試管中，并加入4%雞紅細(xì)胞溶液0.5 mL、15%豚鼠血清0.5 mL，在37℃水浴中靜置1 h后，放入冰水中終止反應(yīng)10 min，在2000 r·min-1離心10 min，取上清液1 mL，加入3 mL現(xiàn)配制的血紅蛋白應(yīng)用液中，于540 nm處比色[11]。

1.2.7 小鼠碳粒廓清能力實驗

動物分組與給藥同1.2.5。給藥后第23天至第29天，除正常組皮下注射生理鹽水外，其余小鼠均皮下注射氫化可的松25 mg·kg-1。給藥后第30天，小鼠灌胃30 min后，小鼠按0.1 mL/10g體重尾靜脈注射以1%明膠配制的25%印度墨汁。于注射后30 s和6 min分別在小鼠眼后靜脈叢用尖嘴吸管取血20μL，加入盛有0.1%Na2CO3于2 mL溶液的試管中，搖勻后于675 nm處分別測定2次吸光值。吞噬指數(shù)K和校正吞噬指數(shù)α公式為：

K=(lgOD1-lgOD2)/(T1-T2)，α=K1/3·W/WLS

式中：OD為吸光度；T為時間；W為體重；WLS為肝脾合重)[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對毛木耳多糖得率的影響

2.1.1 料水比對毛木耳多糖得率的影響

取原料 10.00 g，料液比分別為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，按工藝路線提取多糖。料液比對多糖得率的影響見圖1。

圖1結(jié)果表明，隨著料液比的增加，毛木耳多糖的得率逐漸增加，當(dāng)料液比1∶40時，多糖得率4.97%；當(dāng)料液比超過1∶40，多糖得率增加趨于平穩(wěn)，從節(jié)約成本角度考慮，選擇1∶40為適宜的料液比。

2.1.2 浸提溫度對多糖得率的影響

取原料10.00 g，浸提溫度分別為60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，按工藝路線提取多糖。浸提溫度對多糖得率的影響見圖2。

圖2結(jié)果表明，在試驗溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，多糖的得率逐漸升高，當(dāng)溫度升高到100℃時，多糖得率最高，為5.23%。采用100℃作為水浸提的適宜溫度。

2.1.3 浸提時間對多糖得率的影響

取原料10.00 g，浸提時間分別為1 h、2 h、3 h、4 h和5 h，按工藝路線提取多糖。浸提時間對多糖得率的影響見圖3。

圖3結(jié)果表明，隨著提取時間的延長，毛木耳多糖的得率逐漸增大，當(dāng)浸提時間為4 h時，多糖得率為4.99%，因此選擇浸提時間4 h為宜。

2.1.4 浸提次數(shù)對多糖得率的影響

取原料10.00 g，浸提次數(shù)分別為1次、2次、3次、4次和5次，按工藝路線提取多糖。浸提次數(shù)對多糖得率的影響見圖4。

圖4結(jié)果表明，隨著浸提次數(shù)的增加，毛木耳多糖的得率逐漸增大，當(dāng)浸提次數(shù)達(dá)到2次時，多糖得率達(dá)到4.67%；當(dāng)提取次數(shù)增加，多糖提取率增加趨于平穩(wěn)，從提取成本、節(jié)約能源方面考慮，選擇浸提次數(shù)2次較好。

2.2 毛木耳子實體多糖提取正交試驗

以浸提溫度（A）、浸提時間（B）、料水比（C）和浸提次數(shù)（D）為主要因素，每個組合設(shè)3個重復(fù)，取平均值作為多糖得率，其因素、水平見表1。

表1 正交試驗因素水平

毛木耳多糖提取正交試驗結(jié)果見表2。

表2 毛木耳多糖提取正交試驗結(jié)果

由表2可知，影響毛木耳子實體多糖提取的主要因素依次為C＞D＞B＞A，試驗結(jié)果組合為A3B3C2D1，即料水比1∶40，浸提次數(shù)2次，浸提時間4 h，浸提溫度100℃時，多糖得率最高。

2.3 驗證試驗

最佳工藝條件下進(jìn)行多糖提取驗證試驗結(jié)果見表3。

表3 最佳工藝驗證試驗

試驗結(jié)果表明，在最佳工藝條件下提取多糖，提取率達(dá)到5.90%。

2.4 對小鼠血清溶血素抗體生成的影響

對小鼠血清溶血素抗體生成的影響見表4。

表4 毛木耳多糖對小鼠血清溶血素抗體生成的影響

由表4可見，注射CY(20 mg·kg-1)后模型組血清溶血素水平明顯降低，與空白組比較有顯著性差異（p＜0.01）。而灌胃毛木耳多糖30 d后，血清溶血素抗體生成水平明顯提高，與模型組相比具有顯著差異（p<0.05）并呈劑量關(guān)系。

2.5 小鼠碳粒廓清能力的影響

對小鼠碳粒廓清能力的影響見表5。

表5 毛木耳多糖對小鼠碳粒廓清能力的影響

由表5可見，注射氫化可的松（25 mg·kg-1）后，模型組碳粒廓清能力顯降低，與空白組比較有顯著性差異（p＜0.01）。灌胃毛木耳后多糖30 d后，小鼠碳粒廓清能力有明顯提高（p<0.05）。

3 討論

毛木耳含有豐富的毛木耳多糖，具有提高免疫、抗腫瘤、抗氧化、抗凝血、抗血栓、降血脂等作用。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗及其驗證試驗確定了毛木耳多糖的最佳提取條件為料水比1∶40，浸提時間4 h，浸提次數(shù)2次，浸提溫度100℃，在此條件下，毛木耳多糖得率可達(dá)5.90%。

小鼠溶血素抗體生成試驗，屬于機(jī)體體液特異性免疫實驗中的一種，其實驗原理是通過雞血細(xì)胞免疫小鼠，使血清中出現(xiàn)雞紅細(xì)胞抗體（溶血素）。然后將小鼠血液、豚鼠補體及抗原（雞血細(xì)胞）在適溫下一起孵育，此時發(fā)生溶血反應(yīng)，釋放血紅蛋白。通過Hb試劑盒測定血紅蛋白含量，其可反映血清中溶血素的含量。吸光度越高，表示產(chǎn)生抗體越多，小鼠的免疫能力就越強[13]。通過本論文研究發(fā)現(xiàn)給藥組的吸光度值比模型組大，呈顯著性差異（p＜0.05），表明毛木耳多糖在100 mg·kg-1劑量下可提高免疫低下模型小鼠血清中溶血素抗體含量，具有增強小鼠體液特異性免疫功能的作用。

小鼠碳廓清實驗，屬于機(jī)體巨噬細(xì)胞非特異性免疫實驗中的一種，其實驗原理是當(dāng)小鼠靜脈注入特定大小的惰性碳粒后，它即可被RES細(xì)胞迅速吞噬而從血液中廓清，因此可以借助測定血液中碳粒的消失速度來反映RES吞噬異物的能力[14]。K是反映RES巨噬細(xì)胞對所注入血中碳粒的吞噬廓清能力和速度，由于RES的激活包括巨噬細(xì)胞增殖及功能活躍兩個方面，為排除增殖因素，一般以矯正的α表示。因而測定血液中碳粒的清除速度，速度越快表明吞噬異物能力越強，說明小鼠RES單核巨噬細(xì)胞非特異性免疫的能力越強[15]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)給藥組K值和α值比模型組高，呈顯著性差異（p＜0.05），表明毛木耳多糖在100 mg·kg-1劑量下，可增強免疫低下小鼠巨噬細(xì)胞吞噬碳粒異物的能力，具有增強免疫低下模型小鼠的巨噬細(xì)胞非特異性免疫能力。因此，毛木耳多糖能從體液免疫和細(xì)胞免疫兩個方面提高小鼠的免疫功能。

本文的研究為毛木耳多糖的提取提供了實驗依據(jù)，并且為毛木耳的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。

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