杜木英，余 浪，趙曉娟，吳 均，闞建全,*

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715；3.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室(重慶)，重慶 400715)

豆瓣起源于四川民間，由家庭制作發(fā)展為工業(yè)生產(chǎn)，至今已有200多年的歷史[1]。豆瓣是四川人對蠶豆醬的簡稱，它是以蠶豆等為原料發(fā)酵釀制而成的保持蠶豆瓣原形的半流動(dòng)黏稠體或半固態(tài)調(diào)味品[2]。豆瓣產(chǎn)品有甜豆瓣(不加辣椒)和辣豆瓣(加入辣椒)兩大類[3]。甜豆瓣可以作為商品直接出售，也可以作為半制品來配制辣豆瓣。豆瓣中加入辣椒的產(chǎn)品叫辣豆瓣。辣豆瓣具有鮮、甜、咸、辣、酸等多種調(diào)和的口味，有苯甲醛、苯甲酸甲酯和水楊酸甲酯等80多種香氣成分[4]，能提高食欲、幫助消化，同時(shí)還具有一定的保健功能[5]，是一種深受消費(fèi)者喜愛的方便食品[6]。

傳統(tǒng)豆瓣的生產(chǎn)工藝包括蠶豆去皮浸泡、制曲、加鹽水制醅發(fā)酵、后熟等幾個(gè)步驟[7]。豆瓣中的多種揮發(fā)性香氣成分是在發(fā)酵過程中形成的[8]。按照這種傳統(tǒng)工藝，豆瓣的生產(chǎn)周期至少需要半年以上，投料受季節(jié)限制，且衛(wèi)生指標(biāo)不易控制，產(chǎn)品質(zhì)量很難穩(wěn)定。因此，有必要對豆瓣生產(chǎn)工藝進(jìn)行改進(jìn)研究，為豆瓣的工廠生產(chǎn)提供參考，以使豆瓣的規(guī)?；F(xiàn)代化生產(chǎn)得以發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與試劑

米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、紅曲霉(Monascus)、魯氏酵母(Zygosacharomyces rouxii) 西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院食品微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

麩皮、食鹽、面粉、大米、馬鈴薯、黃豆芽 重慶市北碚區(qū)天生農(nóng)貿(mào)市場；去皮蠶豆、鹽漬辣椒(辣椒品種為“二荊條紅辣椒”、鹽度16.7%) 四川丹丹調(diào)味品公司。

甲醛、氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、無水乙醇、氯化鈉、三氯乙酸 成都科龍化工試劑廠；干酪素 北京市海淀區(qū)微生物培養(yǎng)基制品廠；L-酪氨酸 上海長江生化制藥廠。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C+型酸度計(jì) 成都世紀(jì)方舟科技公司；HH-B11型恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；752型紫外分光光度計(jì) 上海分析儀器廠；JA2003型電子天平 上海精密電子儀器廠；LEICABMLB2型熒光生物顯微鏡 德國萊卡公司；TCP2全自動(dòng)測色色差儀 北京鑫奧依克光電技術(shù)有限公司；DHG-9240型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豆瓣發(fā)酵工藝

1.3.2 菌種配比的確定

在三角瓶中裝入濕料后，分別按照表1中不同的體積比例添加菌懸液(孢子濃度106個(gè)/mL)，于30℃制曲，測蛋白酶活力，確定適宜的菌種配比[9]。

表1 種曲配比表Table 1 Inoculum sizes of Aspergillus oryzae, Aspergillus niger and Monascus anka

1.3.3 制曲時(shí)間和制曲溫度的確定

按照米曲霉、黑曲霉、紅曲霉接種體積比為4：3：1添加菌種，分別在28、30、32℃條件下制豆瓣曲，培養(yǎng)72h，每隔8h取樣，測定樣品的蛋白酶活力，確定最佳制曲時(shí)間和制曲溫度。

1.3.4 發(fā)酵條件的確定

1.3.4.1 發(fā)酵溫度的確定

按照米曲霉、黑曲霉、紅曲霉接種體積比為4：3：1添加菌種制曲，加鹽水后分別于30、35、40、45、50℃條件下發(fā)酵15d[10]，測定產(chǎn)品氨基酸態(tài)氮含量，確定適宜發(fā)酵溫度[11]。

1.3.4.2 食鹽質(zhì)量濃度的確定

按照米曲霉、黑曲霉、紅曲霉接種體積比為4：3：1添加菌種制曲，加鹽水使食鹽質(zhì)量濃度分別為8、10、12、14、16g/100mL，發(fā)酵15d后測定產(chǎn)品氨基酸態(tài)氮含量，確定適宜食鹽質(zhì)量濃度。

1.3.5 發(fā)酵工藝的優(yōu)化

影響發(fā)酵過程的因素有豆瓣曲種類及配比、發(fā)酵溫度、食鹽質(zhì)量濃度[12]，每個(gè)因素選取4個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，測定發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量的變化，并結(jié)合感官評定結(jié)果確定最佳發(fā)酵工藝參數(shù)。

1.3.6 后發(fā)酵條件的確定

1.3.6.1 酵母菌添加量的確定

采用前發(fā)酵最優(yōu)工藝發(fā)酵得到甜瓣子后，分別按質(zhì)量分?jǐn)?shù)0%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%添加酵母菌，再與腌制的辣椒醬按1：1的質(zhì)量比混合，發(fā)酵15d后測氨基酸態(tài)氮的含量，并進(jìn)行感官評定，確定適宜的酵母菌添加量。

1.3.6.2 后發(fā)酵溫度的確定

采用前發(fā)酵最優(yōu)工藝發(fā)酵得到甜瓣子，與腌制的辣椒醬按質(zhì)量比1：1混合，分別于30、35、40、45、50℃發(fā)酵15d，測氨基酸態(tài)氮的含量，并進(jìn)行感官評分，確定適宜的后發(fā)酵溫度。

1.3.6.3 辣椒與甜瓣子質(zhì)量比的確定

采用前發(fā)酵最優(yōu)工藝發(fā)酵得到甜瓣子，分別將辣椒與甜瓣子按5：5、6：4、7：3、8：2、9：1的質(zhì)量比混合，于45℃發(fā)酵15d，測氨基酸態(tài)氮的含量，并進(jìn)行感官評分，確定適宜的后發(fā)酵溫度。

1.3.7 后發(fā)酵工藝的優(yōu)化

豆醬的獨(dú)特風(fēng)味是在其后熟過程中形成的[13]，影響后發(fā)酵的因素有酵母菌添加量、后發(fā)酵溫度、辣椒與甜瓣子質(zhì)量比。每個(gè)因素選取4個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，測氨基酸態(tài)氮含量的變化，并結(jié)合感官評定確定最佳后發(fā)酵條件。

1.3.8 產(chǎn)品理化指標(biāo)測定

蛋白酶活力測定：福林-酚法，在40℃條件下每分鐘水解酵蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸，定義為1個(gè)蛋白酶活力單位(U/g)；氨基酸態(tài)氮：甲醛滴定法[14]。

1.3.9 產(chǎn)品感官評定

選定5人作為感官評價(jià)小組，對豆瓣的色澤、香氣、口感、形態(tài)進(jìn)行評價(jià)[15]，滿分10分，取5人評分的平均值作為評分結(jié)果。感官評價(jià)員應(yīng)該是具有本項(xiàng)目相關(guān)專業(yè)背景，經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的具有評價(jià)員素質(zhì)的人員。產(chǎn)品感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 豆醬感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Standards for sensory evaluation of fermented broad bean sauce

1.3.10 數(shù)據(jù)處理

所有測定指標(biāo)的數(shù)據(jù)平行測定3次后取平均值，應(yīng)用Excel、Origin和SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種配比的確定

表3 蠶豆曲蛋白酶活力Table 3 Protease activities of broad bean koji

分別按照表1中的不同菌種配比添加菌種制曲，測定蛋白酶活力。由表3可知，除試驗(yàn)組5，菌種混合制曲的試驗(yàn)組2～9總蛋白酶活力均高于米曲霉單獨(dú)制曲的試驗(yàn)組1；米曲霉和紅曲霉混合制曲時(shí)試驗(yàn)組3的總蛋白酶活力高于試驗(yàn)組2；米曲霉和黑曲霉混合制曲時(shí)試驗(yàn)組5的總蛋白酶活力高于試驗(yàn)組4；米曲霉、黑曲霉和紅曲霉混合制曲時(shí)試驗(yàn)組7總蛋白酶活力最高。因菌種及其配比對發(fā)酵過程及產(chǎn)品質(zhì)量有重要影響，因此設(shè)計(jì)試驗(yàn)組1、3、5和7進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，從而選出適宜的菌種配比。

2.2 制曲時(shí)間和制曲溫度的確定

圖 1 培養(yǎng)時(shí)間、溫度對米曲霉、黑曲霉與紅曲霉制豆瓣曲蛋白酶活力的影響Fig.1 Effect of culture time and temperature on protease activity of broad bean koji prepared with Aspergillus oryzae, Aspergillus niger and Monascus anka

溫度影響蛋白酶的活力和穩(wěn)定性[16]，原料處理后，分別在1.3.3節(jié)中的溫度條件下進(jìn)行制曲，并定時(shí)測定蛋白酶活力。由圖1可知，在32℃制豆瓣曲時(shí)產(chǎn)生的酶活力最低，并且其蛋白酶活力隨著時(shí)間的延長增加緩慢；而用28℃或30℃制曲時(shí)，蛋白酶活力高低及變化差別不大。因此，制曲溫度控制在28～30℃。

制曲初期，蛋白酶活力均隨著制曲時(shí)間的延長呈對數(shù)增加。在用30℃制曲56h后增加平緩，而在用28℃制曲40h后增加平緩，48h后出現(xiàn)第2次對數(shù)增加現(xiàn)象?？紤]到制曲時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)損失過多且延長發(fā)酵周期，過短又會(huì)導(dǎo)致酶活不高而影響發(fā)酵。因此，制曲時(shí)間應(yīng)控制在40h左右為宜，此時(shí)成品曲菌絲豐滿，菌絲分布均勻一致，曲香濃郁。

2.3 發(fā)酵條件的確定

在酶的作用下，原料中的物質(zhì)進(jìn)行一系列的生物化學(xué)變化，其中包括物質(zhì)的分解和新物質(zhì)的生成，從而組成豆瓣所具有的色、香、味、體[17]。

2.3.1 發(fā)酵溫度的確定

圖 2 發(fā)酵溫度對傳統(tǒng)豆瓣中氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on amino nitrogen content of traditional broad bean sauce

制曲結(jié)束添加鹽水后，分別在1.4.1節(jié)中的溫度條件下進(jìn)行發(fā)酵，測定產(chǎn)品的氨基酸態(tài)氮含量，確定適宜發(fā)酵溫度，結(jié)果見圖2。發(fā)酵溫度對傳統(tǒng)豆瓣中的氨基酸態(tài)氮含量影響顯著。當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃時(shí)，發(fā)酵不完全，氨基酸態(tài)氮含量最低，當(dāng)發(fā)酵溫度為35～50℃時(shí)，氨基酸態(tài)氮均高于30℃時(shí)，因此，選擇發(fā)酵溫度為35、40、45、50℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3.2 食鹽質(zhì)量濃度的確定

制曲后，按照1.3.4.2節(jié)中的食鹽質(zhì)量濃度添加鹽水進(jìn)行發(fā)酵，對發(fā)酵產(chǎn)品進(jìn)行氨基酸態(tài)氮含量的測定，結(jié)果見圖3。食鹽質(zhì)量濃度影響傳統(tǒng)豆瓣中氨基酸態(tài)氮含量。當(dāng)食鹽質(zhì)量濃度為8g/100mL時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量最低，當(dāng)食鹽質(zhì)量濃度為10、12、14、16g/100mL時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量均高于食鹽質(zhì)量濃度8g/100mL時(shí)，并且，食鹽質(zhì)量濃度為8g/100mL時(shí)氨基酸態(tài)氮含量較低，起不到抑制雜菌的目的。因此，選擇食鹽質(zhì)量濃度為10、12、14、16g/100mL進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖 3 食鹽質(zhì)量濃度對傳統(tǒng)豆瓣中氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.3 Effect of salt content on amino nitrogen content of traditional broad bean sauce

2.4 發(fā)酵工藝的優(yōu)化

選擇豆瓣曲種類及配比、發(fā)酵溫度和食鹽質(zhì)量濃度3個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果及直觀結(jié)果分析見表4。影響發(fā)酵豆瓣感官評分的主要因素為發(fā)酵溫度，其次為所選蠶豆曲種類及配比，食鹽質(zhì)量濃度對發(fā)酵結(jié)果影響最小。通過分析可知最優(yōu)組合為A2B3C1，即采用米曲霉與紅曲霉混合制曲，45℃發(fā)酵，食鹽質(zhì)量濃度為10g/100mL。

影響發(fā)酵豆瓣氨基酸態(tài)氮的主要因素為發(fā)酵溫度，其次為食鹽質(zhì)量濃度，所選蠶豆曲種類及配比對發(fā)酵結(jié)果影響最小，三者都對氨基酸態(tài)氮含量有顯著影響，分析可知最佳氨基酸態(tài)氮的組合為A4B3C1。

表4 發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 4 Orthogonal array design for the optimizaiton of primary fermentation conditions

表5 發(fā)酵驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Validation of the optimal primary fermentation conditions

因利用兩個(gè)組合發(fā)酵豆瓣時(shí)，理化指標(biāo)均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，因此主要考慮發(fā)酵條件對產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響。對A2B3C1和A4B3C1這兩個(gè)組合進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的感官評分見表5。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組的氨基酸態(tài)氮含量均達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)，而采用A4B3C1組合發(fā)酵制得的瓣子色澤偏黑，對感官影響較大，導(dǎo)致感官評分較低，故確定采用A2B3C1組合，即采用米曲霉與紅曲霉混合制曲，45℃發(fā)酵，食鹽質(zhì)量濃度為10g/100mL。

2.5 后發(fā)酵條件的確定

2.5.1 酵母菌添加量的確定

表6 酵母菌添加量對傳統(tǒng)豆瓣品質(zhì)的影響Table 6 Effect of yeast inocluation on the quality of traditional broad bean sauce

采用前發(fā)酵最優(yōu)工藝發(fā)酵得到甜瓣子后，分別按1.3.6.1節(jié)中的比例添加酵母菌，再與腌制的辣椒醬混合發(fā)酵，測定發(fā)酵產(chǎn)品的氨基酸態(tài)氮含量，并進(jìn)行感官評定，確定適宜的酵母菌添加量。結(jié)果見表6。與不添加酵母菌相比，添加酵母菌后傳統(tǒng)豆瓣中的氨基酸態(tài)氮含量和感官評分都有所提高，添加酵母菌后，可改善豆醬風(fēng)味。因此，選擇酵母菌的添加量為0.02%、0.04%、0.06%、0.08%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.5.2 后發(fā)酵溫度的確定

表7 后發(fā)酵溫度對傳統(tǒng)豆瓣品質(zhì)的影響Table 7 Effect of secondary fermentation temperature on the quality of traditional broad bean sauce

采用前發(fā)酵最優(yōu)工藝發(fā)酵得到甜瓣子后與腌制的辣椒醬混合，分別按1.3.6.2節(jié)中的溫度進(jìn)行發(fā)酵，測定發(fā)酵產(chǎn)品的氨基酸態(tài)氮含量，并進(jìn)行感官評定，確定適宜的后發(fā)酵溫度。結(jié)果見表7。后發(fā)酵溫度對傳統(tǒng)豆瓣中的氨基酸態(tài)氮含量和感官評分都有顯著影響，在溫度高于35℃時(shí)，傳統(tǒng)豆瓣醬香濃郁，顏色鮮艷，且氨基酸態(tài)氮含量符合國家標(biāo)準(zhǔn)。因此，選擇后發(fā)酵溫度為40、45、50、55℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.5.3 辣椒與甜瓣子混合比例的確定

表8 辣椒與甜瓣子混合比例對傳統(tǒng)豆瓣品質(zhì)的影響Table 8 Effect of mixing ratio for chilli sauce and primarily fermented broad bean on the quality of traditional broad bean sauce

采用前發(fā)酵最優(yōu)工藝發(fā)酵得到甜瓣子后，分別按1.3.6.3節(jié)中的比例與辣椒醬混合進(jìn)行發(fā)酵，測定發(fā)酵產(chǎn)品的氨基酸態(tài)氮含量，并進(jìn)行感官評定，確定適宜的混合比例。結(jié)果見表8。辣椒與甜瓣子混合比例對傳統(tǒng)豆瓣的氨基酸態(tài)氮含量影響顯著，在混合質(zhì)量比為9：1時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量低于國家標(biāo)準(zhǔn)，并且失去豆瓣原有風(fēng)味。因此，選擇辣椒與甜瓣子混合質(zhì)量比為5：5、6：4、7：3、8：2進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.6 后發(fā)酵工藝的優(yōu)化

表9 后發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 9 Orthogonal array design for the optimizaiton of secondary fermentation conditions

在后發(fā)酵過程中添加酵母，對增加風(fēng)味物質(zhì)的形成將非常有效[18]。采用A2B3C1組合制得的甜瓣子按表9進(jìn)行后發(fā)酵正交試驗(yàn)，結(jié)果及分析見表9。影響辣豆瓣后發(fā)酵感官評分的主要因素為發(fā)酵溫度，而辣椒與甜瓣子質(zhì)量比和酵母菌添加量對發(fā)酵感官結(jié)果影響不顯著。分析表明，最優(yōu)組合為A4B2C1或A4B2C2，即添加酵母菌0.06%，辣椒與甜瓣子按1：1或3：2質(zhì)量比混合，在45℃發(fā)酵。影響辣豆瓣后發(fā)酵氨基酸態(tài)氮的主要因素為辣椒與甜瓣子比例，其次為后發(fā)酵溫度，酵母菌添加量對發(fā)酵結(jié)果影響最小。分析表明，獲得最佳氨基酸態(tài)氮的組合為A1B2C1。即不添加酵母菌，辣椒與甜瓣子按1：1質(zhì)量比混合，在45℃發(fā)酵。因酵母菌添加量對感官評價(jià)及氨基酸態(tài)氮影響都不顯著，為節(jié)約成本、簡化工藝，故采用A1B2C1組合，即后發(fā)酵不添加酵母，辣椒與甜瓣子質(zhì)量比為1：1，后發(fā)酵溫度為45℃。

3 結(jié) 論

對傳統(tǒng)豆瓣快速發(fā)酵工藝條件進(jìn)行探索，通過實(shí)驗(yàn)研究獲得了快速發(fā)酵感官指標(biāo)和理化指標(biāo)都很好的豆瓣。通過測定發(fā)酵產(chǎn)品的感官指標(biāo)和理化指標(biāo)，確定了原料預(yù)處理采用燙漂法為宜，通過單因素試驗(yàn)，確定采用米曲霉與紅曲霉體積比為4：3接種，于28～30℃培養(yǎng)40h，可制得優(yōu)良的蠶豆曲。通過正交試驗(yàn)，確定豆瓣的最佳發(fā)酵工藝條件為：加鹽水拌曲后在45℃密閉保溫發(fā)酵10d即可制得甜瓣子，將甜瓣子與腌制的辣椒醬按1：1質(zhì)量比混合后，在45℃進(jìn)行后發(fā)酵15d。此條件下發(fā)酵時(shí)間為28d，比傳統(tǒng)工藝至少縮短了5個(gè)月，且制得的辣豆瓣品質(zhì)優(yōu)良，風(fēng)味濃郁。

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