王 艷，程惠娟*，朱玲玲，孫振新，李露天

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230038)

每年由細(xì)菌感染造成的死亡人數(shù)超過(guò)13萬(wàn)，是世界第二大死亡原因，其中細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性對(duì)人類生存構(gòu)成了重大威脅[1]。細(xì)菌形成的生物被膜是細(xì)菌易產(chǎn)生耐藥性的重要因素。1978年Costerton首先發(fā)現(xiàn)并提出了生物被膜(biofilm)理論[2]。隨后，一些研究者在難治性的慢性呼吸道感染、慢性泌尿系感染、骨髓炎、心內(nèi)膜炎、前列腺炎的病例中，都發(fā)現(xiàn)了生物被膜細(xì)菌[3]。細(xì)菌的生物被膜是細(xì)菌為適應(yīng)周圍不利環(huán)境，分泌的多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂蛋白等將其自身包繞其中形成的膜樣物，是細(xì)菌群體生長(zhǎng)的一種方式，較之于浮游菌，被膜內(nèi)菌對(duì)抗生素及殺菌劑耐受力更強(qiáng)[4-6]，因此，尋找以生物被膜為靶向的藥物是解決目前細(xì)菌耐藥性的重要突破口。

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pa)是一種常見(jiàn)的院內(nèi)感染條件致病菌，被世界衛(wèi)生組織公認(rèn)為醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原菌之一，臨床上常見(jiàn)于呼吸道感染[7]。該菌在感染機(jī)體過(guò)程中常以生物被膜方式存在，以此來(lái)阻隔抗生素的攻擊[8-9]。在前期的研究中，課題組成功通過(guò)體外銅綠假單胞菌產(chǎn)膜株的感染建立了肺氣虛證的模型[10-13]，并針對(duì)此病理模型的治療進(jìn)行了大范圍的藥物篩查。

魚(yú)腥草為三白草科蕺菜屬植物蕺菜的干燥地上部分和新鮮全草，味辛、微寒、歸肺經(jīng)，具有清熱解毒、利尿通淋、止血、祛痰止咳、鎮(zhèn)痛等多種功能。目前，魚(yú)腥草被國(guó)家衛(wèi)生部正式確定為“既是藥品，又是食品”的極具開(kāi)發(fā)潛力的植物資源之一[14-15]。魚(yú)腥草素鈉是魚(yú)腥草的主要有效成分和亞硫酸氫鈉加成物，是臨床常用藥物魚(yú)腥草注射液的主要成分，具有消腫，抗化膿感染的功效。主治呼吸道感染及皮膚化膿感染[16-17]。對(duì)老年人肺炎、急性上呼吸道感染、慢性支氣管炎急性發(fā)作期均有良好的療效[18-19]。在前期的體外抗菌實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，魚(yú)腥草素鈉相較抗生素而言抗菌作用不顯著，但在治療由銅綠假單胞菌生物被膜感染造成的大鼠肺氣虛證模型時(shí)，效果理想。而且有實(shí)驗(yàn)證實(shí)魚(yú)腥草素鈉對(duì)表皮葡萄球菌生物被膜有影響[20]，因此推測(cè)該藥是否通過(guò)干擾銅綠假單胞菌生物被膜的形成，解除它的生物屏蔽作用，從而促進(jìn)機(jī)體的免疫因素殺滅細(xì)菌。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚(yú)腥草素鈉標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)100247-199601) 中國(guó)藥品生物制品檢定所；標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853 中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；LB培養(yǎng)基、胰酶大豆肉湯培養(yǎng)基、M-H培養(yǎng)基 杭州微生物試劑有限公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT) 美國(guó)Sigma公司；二甲基亞砜(DMSO) 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

318酶標(biāo)儀 上海三科儀器有限公司；96孔微量培養(yǎng)板 杭州生友生物技術(shù)有限公司；DPH-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；CX21型光學(xué)顯微鏡 日本Olympus公司；Sirion200型場(chǎng)掃描電鏡 美國(guó)Fei公司。

1.3 方法

1.3.1 魚(yú)腥草素鈉對(duì)銅綠假單胞菌的MIC及抗菌活性

魚(yú)腥草素鈉對(duì)銅綠假單胞菌的MIC參考ANSI推薦的NCCLS M7-A方案用微量稀釋法進(jìn)行，魚(yú)腥草素鈉以M-H培養(yǎng)基對(duì)倍稀釋成10個(gè)質(zhì)量濃度梯度：300、150、75、37.5、18.75、9.38、4.69、2.34、1.17、0.59μg/mL，分別加入96孔板中，每個(gè)質(zhì)量濃度8個(gè)復(fù)孔，100μL/孔。另設(shè)一列不含魚(yú)腥草素鈉的培養(yǎng)基作為正常對(duì)照組，6h培養(yǎng)的菌液以比濁法調(diào)整到0.5號(hào)麥?zhǔn)蠞舛龋?jīng)200倍稀釋后，每孔加入100μL，振蕩，37℃培養(yǎng)18h，以無(wú)菌生長(zhǎng)的最小藥物稀釋度為MIC。然后在酶標(biāo)儀650nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD650nm值，比較各藥物質(zhì)量濃度的抗菌活性。

1.3.2 魚(yú)腥草素鈉對(duì)銅綠假單胞菌代謝影響

將魚(yú)腥草素鈉用胰酶大豆肉湯稀釋成10個(gè)質(zhì)量濃度梯度：300、150、75、37.5、18.75、9.38、4.69、2.34、1.17、0.59μg/mL，分別加入96孔板，100μL/孔，每個(gè)質(zhì)量濃度8個(gè)復(fù)孔，第11、12列的8個(gè)復(fù)孔中加入100μL不含魚(yú)腥草素鈉的胰酶大豆肉湯，11列為不加魚(yú)腥草素鈉的正常對(duì)照組，12列作為培養(yǎng)基空白對(duì)照，1～11列各孔中加入100μL 1×104CFU/mL的細(xì)菌懸浮液；37℃培養(yǎng)每隔48h換一次含藥培養(yǎng)基，設(shè)1、3、7d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，MTT法在酶標(biāo)儀492nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD492nm計(jì)算SMIC50和SMIC80。

1.3.3 魚(yú)腥草素鈉抗銅綠假單胞菌生物被膜動(dòng)態(tài)過(guò)程的形態(tài)觀察

選用SMIC80作為含藥培養(yǎng)基的藥物最終質(zhì)量濃度，將含藥培養(yǎng)基分別加入到六孔板中設(shè)1、3、7d時(shí)間點(diǎn)3個(gè)孔，3.6mL/孔，另設(shè)相應(yīng)不含藥正常對(duì)照孔，將400μL的1×104CFU/mL的銅綠假單胞菌的菌體混懸液加入六孔板中，各孔放入1片無(wú)菌蓋玻片作為載體，37℃培養(yǎng)，每48h換一次含藥培養(yǎng)基，分別取出蓋玻片，PBS充分清洗浮游菌后鍍銀染色，掃描電鏡下觀察形態(tài)。

1.3.4 載體濾膜上活菌計(jì)數(shù)

體外生物被膜構(gòu)建同1.3.3節(jié)。設(shè)魚(yú)腥草素鈉對(duì)銅綠假單胞菌代謝影響實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的SMIC50藥物質(zhì)量濃度為低劑量藥物組，SMIC80藥物質(zhì)量濃度為高劑量藥物組，載體選用孔徑0.22μm醫(yī)用濾膜，設(shè)1、3、7d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取出濾膜，用生理鹽水多次漂洗，洗去浮游菌，濾膜剪碎放入存有5mL無(wú)菌生理鹽水的試管，超聲振蕩(超聲頻率40kHz)20min，使膜內(nèi)菌釋放，連續(xù)稀釋法，傾注培養(yǎng)計(jì)算活菌數(shù)。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 魚(yú)腥草素鈉對(duì)銅綠假單胞菌的MIC及抗菌活性

魚(yú)腥草素鈉對(duì)銅綠假單胞菌的MIC為300μg/mL，由圖1可知，與正常對(duì)照組比較，300μg/mL魚(yú)腥草素鈉抗銅綠假單胞菌作用顯著(P＜0.01)，隨著魚(yú)腥草素鈉質(zhì)量濃度減小，抗菌活性減弱，150、75、37.5μg/mL魚(yú)腥草素鈉之間還有一定的抗菌活性(P＜0.05，P＜0.01)。

圖 1 魚(yú)腥草素鈉對(duì)銅綠假單胞菌抗菌活性(±s，n=4)Fig.1 Antibacterial activity of sodium houttuyfonate against Pseudomonass aeruginosa (±s，n=4)

2.2 魚(yú)腥草素鈉對(duì)銅綠假單胞菌代謝影響

不加藥的含菌培養(yǎng)孔的OD492nm為1，含藥孔的光密度是對(duì)照孔的0.2、0.5倍即為SMIC80、SMIC50，結(jié)果見(jiàn)表1。SMIC80、SMIC50和正常對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.01)，見(jiàn)圖2。

表1 魚(yú)腥草素鈉對(duì)銅綠假單胞菌的SMIC(±s，n=4)Table 1 SMIC of sodium houttuyfonate against Pseudomonas aeruginosa (±s，n=4)μg/mL

表1 魚(yú)腥草素鈉對(duì)銅綠假單胞菌的SMIC(±s，n=4)Table 1 SMIC of sodium houttuyfonate against Pseudomonas aeruginosa (±s，n=4)μg/mL

組別 培養(yǎng)時(shí)間/d 1 3 7魚(yú)腥草素鈉SMIC509.3818.7537.5魚(yú)腥草素鈉SMIC8037.537.5150

圖 2 魚(yú)腥草素鈉對(duì)銅綠假單胞菌代謝影響(±s，n=4)Fig.2 Effect of sodium houttuyfonate on the metabolism of Pseudomonas aeruginosa ((±s，n=4)

2.3 魚(yú)腥草素鈉抗銅綠假單胞菌生物被膜動(dòng)態(tài)過(guò)程的形態(tài)觀察

由圖3可知，正常對(duì)照組銅綠假單胞菌從黏附到成熟生物被膜形成的過(guò)程，銅綠假單胞菌培養(yǎng)1d在載體上已經(jīng)完成了吸附并形成了微菌落集團(tuán)，周圍可見(jiàn)到少量黏液，給藥組培養(yǎng)1d細(xì)菌量少，可見(jiàn)藥物干擾了細(xì)菌吸附到載體上。正常對(duì)照組3d培養(yǎng)的載體可觀察到初步生物被膜形態(tài)，細(xì)菌已經(jīng)被生物被膜覆蓋，但是依稀還能看到細(xì)菌形態(tài)，培養(yǎng)到7d時(shí)由黏液組成的生物被膜增厚，細(xì)菌完全被埋到膜內(nèi)致使菌體不可見(jiàn)。給藥組1d和3d的載體菌體清晰，但是菌體表面較藥物作用7d的菌體粗糙可能是細(xì)菌還有少量黏液分泌所致，但是細(xì)菌周圍未見(jiàn)黏液，藥物作用3d的載體細(xì)菌數(shù)量多于作用1d的載體，可能是細(xì)菌在載體上繁殖所致，藥物作用7d時(shí)載體菌量少，且菌體光滑，可見(jiàn)隨著藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)細(xì)菌分泌黏液抑制作用增強(qiáng)，且載體上細(xì)菌較3d藥物作用的載體少，可能是菌體表面變得光滑不易吸附載體所致。

圖 3 魚(yú)腥草素鈉抗銅綠假單胞菌生物被膜形態(tài)觀察(×20000)Fig.3 Morphological observation of Pseudomonas aeruginosa biofilm formed in the presence or absence of sodium houttuyfonate(×20000)

2.4 載體濾膜上活菌計(jì)數(shù)

表2 載體濾膜上的活菌計(jì)數(shù)(±s，n=4)Table 2 Live bacterial count on carrier in the membrane filter(±s，n=4)104 CFU/mL

表2 載體濾膜上的活菌計(jì)數(shù)(±s，n=4)Table 2 Live bacterial count on carrier in the membrane filter(±s，n=4)104 CFU/mL

注：*. 與正常對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)；**.與正常對(duì)照組相比差異極顯著(P＜0.01)。

組別 培養(yǎng)時(shí)間/d 1 3 7正常對(duì)照組955±2881130±3021026±451魚(yú)腥草素鈉低劑量組831±228*785±177*234±14**魚(yú)腥草素鈉高劑量組375±249**147±38**129±24**

由表2可知，魚(yú)腥草素鈉藥物組載體濾膜上的活菌數(shù)明顯少于未用魚(yú)腥草素鈉作用的正常對(duì)照組，其中魚(yú)腥草素鈉高劑量組在黏附階段、初步生物被膜形成、成熟生物被膜形成階段與正常對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.01)，尤其在成熟生物被膜形成階段，低劑量組與正常對(duì)照組相比也差異顯著。

3 討 論

自然界細(xì)菌以浮游和生物被膜兩種生活方式存在，當(dāng)細(xì)菌處于浮游狀態(tài)時(shí)常導(dǎo)致急性感染的發(fā)生，生物被膜狀態(tài)的細(xì)菌引起慢性感染。雖然也有多種抗生素有抗生物被膜的作用，且抗生素殺菌作用較強(qiáng)，但是當(dāng)慢性感染時(shí)，長(zhǎng)期使用抗生素是不合適的。目前臨床治療生物被膜病仍以抗生素治療為主，抗生素對(duì)于細(xì)菌生物被膜病的治療是一個(gè)時(shí)間較長(zhǎng)的過(guò)程，在抗生素選擇性壓力下這一過(guò)程將加大細(xì)菌耐藥性變異的頗率，而天然植物藥和抗生素相比具有較少形成耐藥性，毒副作用小兩大優(yōu)點(diǎn)。

魚(yú)腥草生長(zhǎng)在中國(guó)中東部以及西南地區(qū)，作為“藥食兩用”植物已經(jīng)有2000多年歷史。魚(yú)腥草、魚(yú)腥草素鈉在臨床治療慢性感染性疾病有很好的療效，由于慢性感染性疾病的反復(fù)發(fā)作、遷延不愈與細(xì)菌形成生物被膜相關(guān)，因此推測(cè)魚(yú)腥草素鈉可能通過(guò)抑制細(xì)菌生物被膜達(dá)到對(duì)慢性感染性疾病的治療效果。本研究體外實(shí)驗(yàn)顯示魚(yú)腥草素鈉300μg/mL抗銅綠假單胞菌的活性最強(qiáng)，隨著藥物質(zhì)量濃度減少抗菌活性減弱，至18.75μg/mL及以下質(zhì)量濃度幾乎無(wú)抑菌作用。但是其干擾生物被膜的作用強(qiáng)于它的抗菌活性，根據(jù)Sauer等[21]報(bào)道的銅綠假單胞菌生物被膜的形成階段，本實(shí)驗(yàn)選擇1、3、7d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)作為生物被膜形成過(guò)程的黏附階段、初步生物被膜形成階段、成熟生物被膜形成階段，從膜內(nèi)菌代謝變化的最小抑膜質(zhì)量濃度顯示魚(yú)腥草素鈉有較強(qiáng)的抗銅綠假單胞菌生物被膜的活性，細(xì)菌培養(yǎng)1d是細(xì)菌的黏附階段，抑制50%和80%的細(xì)菌黏附需要9.37、75μg/mL的藥物質(zhì)量濃度，培養(yǎng)3d干擾初步生物被膜SMIC50、SMIC80分別是18.75μg/mL和37.5μg/mL藥物質(zhì)量濃度，培養(yǎng)7d干擾成熟生物被膜SMIC50、SMIC80分別是37.5、150μg/mL。從干擾成熟生物被膜的藥物質(zhì)量濃度對(duì)照MIC分析，結(jié)合掃描電鏡對(duì)生物被膜形態(tài)變化的觀察，藥物質(zhì)量濃度必須要用抗菌活性才有干擾生物膜的作用?；罹囵B(yǎng)檢測(cè)表明，魚(yú)腥草素鈉在黏附，初步生物膜、成熟生物膜階段都具有明顯的干預(yù)作用。結(jié)合以上體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，魚(yú)腥草素鈉對(duì)銅綠假單胞菌產(chǎn)膜株所致肺氣虛證模型的具體影響還有待動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。由于魚(yú)腥草素鈉可以通過(guò)消除生物屏蔽，進(jìn)而促進(jìn)抗生藥物的滲透，致使藥物直接作用細(xì)菌，殺滅細(xì)菌，除此之外也有利于機(jī)體抗體和吞噬細(xì)胞發(fā)揮抗感染作用。因此如果和抗生素聯(lián)合治療生物膜相關(guān)的感染，應(yīng)該可以收到更好的療效。

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