郭全友，王錫昌*，姜朝軍，張書萍，江 航，趙克儉

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；3.上海理工大學(xué)理學(xué)院，上海 200090)

魚類被認(rèn)為是人們膳食中極有價(jià)值的蛋白質(zhì)來源，因其肉味鮮美，肉質(zhì)細(xì)嫩而受到人們的喜愛。羅非魚作為一種高消費(fèi)量和高商業(yè)利潤的世界性養(yǎng)殖魚類，具有食性雜、耐低氧、不耐低高溫，繁殖強(qiáng)等特點(diǎn)，并且肉質(zhì)厚、骨刺少，富含多種不飽和脂肪酸，被公認(rèn)為健康食品，稱其為“21 世紀(jì)之魚”[1]。中國羅非魚產(chǎn)量約占世界產(chǎn)量的55%，絕大部分以鮮活流通為主，但運(yùn)輸難、成本高，以保持低溫環(huán)境為核心要求的供應(yīng)鏈系統(tǒng)得以應(yīng)用。近年來研究者對(duì)羅非魚低溫貯藏過程質(zhì)量變化和細(xì)菌種群等進(jìn)行了研究，構(gòu)建了特定腐敗菌(specific spoilage organisms，SSO)生長動(dòng)力學(xué)模型和貨架期預(yù)測(cè)模型[2-6]。供應(yīng)鏈中始終保持低溫并非易事，實(shí)際中往往脫離冷卻鏈甚至濫用溫度，夏季時(shí)魚體溫度可能達(dá)到室溫。低溫和室溫下魚類SSO差別甚大，一旦超出設(shè)定的低溫范圍，貨架期預(yù)測(cè)模型將無法使用。因此必須要選擇和測(cè)定有效的質(zhì)量指標(biāo)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)要覆蓋所有可能范圍的溫度條件，選擇合適的動(dòng)力學(xué)模型，進(jìn)而開發(fā)新的貨架期預(yù)測(cè)模型，并經(jīng)過變溫和恒溫等實(shí)際流通條件的驗(yàn)證。

每種水產(chǎn)品在給定條件下都有自身特有的優(yōu)勢(shì)菌群、腐敗范圍和腐敗特征等，特別對(duì)新產(chǎn)品或改進(jìn)型產(chǎn)品的腐敗菌和腐敗范圍往往還未知曉，進(jìn)行相關(guān)研究可為理解腐敗現(xiàn)象和靶向抑制提供基礎(chǔ)[7-9]。溫度對(duì)貨架期的影響常用腐敗速率(rate of spoilage，RS)，即貨架期的倒數(shù)(d-1)進(jìn)行測(cè)定[10-12]。研究發(fā)現(xiàn)雖然新鮮水產(chǎn)品間貨架期差異顯著，但溫度對(duì)相對(duì)腐敗速率(relative rate of spoilage，RRS)的影響具有相似性[6]，RRS模型是依據(jù)不同溫度下的貨架期來開發(fā)的，其優(yōu)點(diǎn)是能在較大的溫度范圍內(nèi)得到驗(yàn)證，僅僅需要提供產(chǎn)品所經(jīng)歷的溫度時(shí)間履歷即可，是不同溫度下貨架期計(jì)算的有效和簡單易用的工具。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)低溫(0～10℃)和室溫(25℃)貯藏下魚體感官、理化和微生物指標(biāo)的系統(tǒng)研究，確定不同溫度與貨架期之間的相關(guān)性，并對(duì)貨架期預(yù)測(cè)模型的性能和適用性進(jìn)行評(píng)價(jià)及驗(yàn)證，旨在運(yùn)用該模型和溫度時(shí)間履歷獲得0～25℃范圍內(nèi)任何點(diǎn)處剩余貨架期信息。同時(shí)，雖然對(duì)尼羅羅非魚室低溫貯藏期間的細(xì)菌種群進(jìn)行了研究[13-16]，但室溫貯藏時(shí)優(yōu)勢(shì)腐敗菌的種類和腐敗力仍然未知，因此有必要對(duì)低溫和室溫下優(yōu)勢(shì)腐敗菌的差異進(jìn)行研究，為探究不同溫度范圍內(nèi)導(dǎo)致產(chǎn)品腐敗的內(nèi)在原因，為最大限度減少變質(zhì)產(chǎn)品數(shù)量和改善消費(fèi)時(shí)的品質(zhì)分布，構(gòu)建集動(dòng)力學(xué)模型和溫度時(shí)間履歷監(jiān)控于一體的高效供應(yīng)鏈管理系統(tǒng)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品制備及貯存

尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)產(chǎn)自廣東茂名地區(qū)，鮮活運(yùn)輸至上海銅川路水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)等，運(yùn)達(dá)試驗(yàn)室后(平均體質(zhì)量：450g，平均長度：240mm)冰水冷卻致死，放于高精度低溫培養(yǎng)箱進(jìn)行低溫(0、3、5、8、10℃)、室溫(25℃)和貯藏變溫(A：0℃、136h→5℃、41h→15℃、41h→25℃、7h→8℃、48h)貯藏，貯藏期間合適間隔取樣，用溫度時(shí)間記錄儀監(jiān)控溫度變化，每1h記錄一次。

1.2 試劑與儀器

營養(yǎng)和鐵瓊脂瓊脂培養(yǎng)基 上海昆蟲科技開發(fā)公司；GNID和GPID測(cè)試板 英國TREK Diagnostic Systems LTD公司；假單胞菌專用培養(yǎng)基 英國Oxoid公司；Sensititre微生物鑒定系統(tǒng) 英國Trek Diagnostic System Ltd公司；自動(dòng)菌落成像分析系統(tǒng)、拍打式均質(zhì)器、全自動(dòng)微生物平皿螺旋加樣器 西班牙IUL公司；培養(yǎng)箱 日本Sanyo 公司；微生物鑒定系統(tǒng) 美國MIDI公司；175-T2時(shí)間溫度記錄儀 德國Testo公司；CX41生物顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 樣品處理

低溫、室溫和變溫貯藏的試驗(yàn)次數(shù)(n)，見表1。每次隨機(jī)抽取3尾試樣魚，先進(jìn)行生魚感官評(píng)價(jià)，然后采用GB/T 18108－2000《鮮海水魚》的取樣方法，樣品魚去鱗去內(nèi)臟去腮，洗凈后沿脊骨無菌剖切，半條魚蒸熟后用于感官評(píng)價(jià)，用均質(zhì)器將另半條魚肉打碎，進(jìn)行菌落總數(shù)(total viable counts，TVC)、產(chǎn)H2S菌等計(jì)數(shù)，以及揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen，TVBN)的測(cè)定。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

感官評(píng)價(jià)、TVC、假單胞菌數(shù)、產(chǎn)H2S菌數(shù)、TVBN和貨架期判定方法參照文獻(xiàn)[2-3,17]。

細(xì)菌鑒定：對(duì)整個(gè)平板或一定區(qū)域內(nèi)所有菌落(通常30～100CFU)，依據(jù)菌落形態(tài)、革蘭氏染色、細(xì)胞形態(tài)，芽孢有無，運(yùn)動(dòng)性及氧化/發(fā)酵等特征，采用雙歧分類法進(jìn)行分組，每組挑取所有菌落或若干菌落(至少2～3CFU)，分離純化25℃培養(yǎng)24～48h。細(xì)菌鑒定參考文獻(xiàn)[17-19]進(jìn)行多相分類，并對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行16S rRNA序列進(jìn)行測(cè)定，PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠回收后交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，先進(jìn)行DNA克隆，由DNA自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.5 相對(duì)腐敗速率模型

平方根腐敗速率模型起初用于評(píng)價(jià)微生物的生長，亦用于評(píng)估溫度對(duì)鮮魚貨架期的影響(式(1))，RRS被定義為溫度(T/℃)的腐敗速率除以參考溫度的腐敗速率，即參考溫度時(shí)貨架期除以T時(shí)的貨架期[10]，見式(2)。

式中：k為與反應(yīng)系統(tǒng)物質(zhì)本性有關(guān)的經(jīng)驗(yàn)常數(shù)；T為貯藏溫度/℃；Tref為參考溫度；Tmin為理論最小溫度。

1.6 預(yù)測(cè)模型性能評(píng)價(jià)

比較模型性能(performance)最有效的手段之一是預(yù)測(cè)值和真實(shí)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，常采用決定系數(shù)(R2)、殘差平方和(residual sum of squares，RSS)、偏差度(bias factor，BF)、準(zhǔn)確度(accuracy factor，AF)、均方根誤差(root mean square error，RMS)對(duì)模型的擬合優(yōu)度(goodness of fit)進(jìn)行評(píng)價(jià)[20]，即：

式(3)～(6)中：RSS表示隨機(jī)誤差的效應(yīng)，用于解釋變量和隨機(jī)誤差所產(chǎn)生的效應(yīng)；BF和AF兩者均由幾何平均值得到，偏差度用來檢查預(yù)測(cè)值的上下波動(dòng)幅度，準(zhǔn)確度用來衡量預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間的差異；當(dāng)m=2時(shí)，RMS為均方根誤差，可有效指示模型與數(shù)據(jù)點(diǎn)間的均差，被廣泛用于評(píng)價(jià)模型的擬合優(yōu)度。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Statistica(Release 5.5)統(tǒng)計(jì)軟件(StsatSoft, Inc.)進(jìn)行單因素方差分析及最小顯著差異法分析，當(dāng)P＞0.05時(shí)差異不顯著，采用最小平方差法進(jìn)行曲線擬合和評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 0～25℃貯藏尼羅羅非魚的品質(zhì)特征

表 1 低溫和室溫貯藏尼羅羅非魚品質(zhì)特征和貨架期Table 1 Shelf life and quality characteristics of Oreochromis niloticus stored at low and ambient temperatures

鮮品貯藏的初始階段，品質(zhì)損失主要是自溶酶等作用引起的，其后，適應(yīng)貯藏環(huán)境的腐敗菌逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，產(chǎn)生硫化物、有機(jī)酸、醛酮類等腐敗產(chǎn)物。羅非魚低溫貯藏初始感官評(píng)價(jià)良好，菌落總數(shù)、假單胞菌、產(chǎn)H2S菌和TVBN分別為(4.41±1.13)、(3.39±1.09)、(2.01±0.88)(lg(CFU/g))和(8.53±0.73)mg/100g。低溫(0～10℃)貯藏時(shí)貨架期終點(diǎn)時(shí)菌落總數(shù)、假單胞菌、產(chǎn)H2S菌和TVBN分別為(7.79±0.35)、(7.24±0.45)、(6.35±0.23)(lg(CFU/g))和(19.90±2.10)mg/100g，無顯著性差異(P＞0.05)。表1顯示，室溫貯藏時(shí)的貨架期終點(diǎn)假單胞菌數(shù)處在較低水平(5.92±0.02)(lg(CFU/g))，TVBN為(24.07±0.39)mg/100g，室溫下的假單胞菌數(shù)明顯低于低溫下的數(shù)量，而產(chǎn)H2S菌數(shù)高于低溫時(shí)的數(shù)量，表明室溫和低溫過程參與腐敗的細(xì)菌種類可能較大存在差異，因此，采用雙歧法、數(shù)值法和16S rRNA測(cè)序法對(duì)細(xì)菌菌群進(jìn)行分類鑒定。

2.2 0～25℃貯藏尼羅羅非魚的細(xì)菌種群

表 2 低溫和室溫貯藏尼羅羅非魚貨架期終點(diǎn)細(xì)菌種群組成Table 2 Flora compositions of cultivated Oreochromis niloticus stored at low and ambient temperatures at the end of shelf life

表2所示，貨架期終點(diǎn)時(shí)，從0～10℃冷藏樣品中共分離獲得255株細(xì)菌，從25℃室溫貯藏樣品中分離到84株菌，第1～9組依次為假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)、腐敗希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)、不動(dòng)細(xì)菌屬(Acinetobacter spp.)、氣單胞菌屬(Aeromonas spp.)、水生黃桿菌(Flavobacterium aquatlis)、嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter spp.)、棒狀菌屬(Corynebacterium spp)、沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)。低溫貯藏羅非魚貨架期終點(diǎn)時(shí)假單胞菌占主導(dǎo)地位(表2)，255株菌中有147株鑒別為假單胞菌，該菌為運(yùn)動(dòng)性的革蘭氏陰性桿菌，過氧化氫酶和氧化酶陽性，不產(chǎn)生H2S和三甲胺，也出現(xiàn)了一定比例的腐敗希瓦氏菌(10.2%)、嗜冷桿菌(11.4%)和少量的氣單胞菌(8.6%)。氣單胞菌是室溫(25℃)貯藏羅非魚的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，84株菌中有69株鑒定為氣單胞菌，比例為82.1%，該菌具有單鞭毛，有動(dòng)力，為發(fā)酵型革蘭氏陰性菌，其中30株產(chǎn)生H2S，39株不產(chǎn)生H2S，對(duì)其腐敗力的差異有待進(jìn)一步研究。

2.3 溫度特征與相對(duì)腐敗速率

依據(jù)表1中數(shù)據(jù)，利用式(1)、(2)可推導(dǎo)出0～25℃條件下的RS和RRS，以0℃為參考溫度，對(duì)0、5、10℃和25℃的RRS平方根數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，見圖1，得到R R S=(1+0.1 1 T)2(式(7))，R2=0.9 8 5 9，可推導(dǎo)出Tmin=－8.9℃。采用BF、AF、RRS和RMS對(duì)方程7性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，由表3可知，準(zhǔn)確度=1.10，說明預(yù)計(jì)值和實(shí)際值之間的平均差異為10%；偏差1.0表示預(yù)計(jì)值沒有系統(tǒng)錯(cuò)誤，0.75～1.25被認(rèn)為是可靠的[20]，依據(jù)方程3可知偏差度為1.10，表示預(yù)計(jì)值的偏差為10%，處在0.75～1.25范圍內(nèi)，因此該模型是可靠的。

圖 1 尼羅羅非魚平方根相對(duì)腐敗速率與溫度相關(guān)性Fig.1 Typical linear relationship for Oreochromis niloticus between square root of RRS and temperatures

表 3 平方根RRS模型的預(yù)測(cè)與評(píng)價(jià)Table 3 Assessment and prediction of square root RRS model

2.4 恒溫和變溫條件下貨架期預(yù)測(cè)模型驗(yàn)證

依據(jù)式(7)，以0℃作為參考溫度，推導(dǎo)出恒溫下的貨架期預(yù)測(cè)模型(式(8))。在生產(chǎn)和流通中溫度變化通常是隨機(jī)的，因此沒有數(shù)學(xué)表達(dá)式可以用來描述時(shí)間-溫度變化，剩余貨架期預(yù)測(cè)方法是把時(shí)間-溫度歷史分割成假設(shè)為很短的溫度時(shí)間區(qū)間，利用式(8)，把所經(jīng)歷不同溫度下的時(shí)間(storage time，ST)累計(jì)為參考溫度下的時(shí)間，求出與參考溫度下的貨架期之差，進(jìn)而可以導(dǎo)出變溫下的剩余貨架期(式(9))。表4所示，利用式(8)、(9)，3、8℃恒溫和變溫(A：0℃、136h→5℃、41h→15℃、41h→25℃、7h→8℃、48h)的貨架期的預(yù)測(cè)值分別為11.2、5.6d和9.1d，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值相對(duì)誤差分別為－13.8～－4.2%，表明該模型能較好預(yù)測(cè)恒溫和變溫下貨架期。

表 4 恒溫和變溫下尼羅羅非魚貨架期預(yù)測(cè)模型驗(yàn)證Table 4 Validation on predicted shelf life of Oreochromis niloticus under isothermal and non-isothermal conditions

3 結(jié) 論

3.1 通過對(duì)低溫(0～10℃)和室溫(25℃)貯藏尼羅羅非魚的感官、TVBN、TVC、假單胞菌數(shù)、產(chǎn)H2S菌數(shù)和細(xì)菌菌相等分析，確定低溫下貨架期為5.5～20.1d，優(yōu)勢(shì)腐敗菌為腐假單胞菌，室溫下貨架期僅1.3d，優(yōu)勢(shì)腐敗菌為氣單胞菌。

3.2 采用Square-Root模型確定了不同溫度下的相對(duì)腐敗速率等，得到最小溫度為－8.9℃，開發(fā)出羅非魚平方根腐敗速率模型，并采用R2、RSS、BF、AF和RMS對(duì)模型的擬合優(yōu)度進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示平方根預(yù)測(cè)模型具有較好的預(yù)測(cè)性能。

3.3 構(gòu)建了0～25℃范圍內(nèi)的貨架期和剩余貨架期預(yù)測(cè)模型，用3、8℃恒溫和變溫下的貨架期進(jìn)行驗(yàn)證，相對(duì)誤差為－13.8%～－4.2%，顯示平方根貨架期模型的預(yù)測(cè)性能良好，在恒溫和變溫等實(shí)際流通鏈中具有實(shí)用性。

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