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        UPLC-MS/MS分析橘汁發(fā)酵液中檸檬苦素的變化趨勢(shì)

        2013-08-07 09:07:22李新生吳三橋張志健胥彥明
        食品科學(xué) 2013年4期
        關(guān)鍵詞:苦素果酒苦味

        江 海,李新生,*,吳三橋,張志健,劉 新,韓 豪,高 玥,彭 浩,胥彥明

        (1.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院,陜西 漢中 723000;2.陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 漢中 723000;3.陜西城固酒業(yè)有限公司,陜西 城固 723200)

        柑橘是世界第一大水果,世界柑橘常年總產(chǎn)量6000~10000萬(wàn)t。分布于全球140個(gè)國(guó)家和地區(qū),其中柑橘產(chǎn)量居世界前3位的分別為巴西、美國(guó)、中國(guó)[1-3]。我國(guó)柑橘經(jīng)濟(jì)栽培區(qū)主要集中在北緯20~33°之間,海拔700~1000m以下的亞熱帶、熱帶地區(qū),年栽培面積133~200萬(wàn)公頃之間,占世界栽培面積的20%,其中長(zhǎng)江上中游柑橘帶、贛南-湘南-桂北柑橘帶、浙南-閩西-粵東柑橘帶為我國(guó)柑橘優(yōu)勢(shì)栽培區(qū)[4]。2007年,我國(guó)柑橘種值面積和產(chǎn)量均居世界首位[5],主要包括日南1號(hào)、宮川、山下紅、大浦、興津等100多個(gè)品中。其中寬皮橘類占80%以上,多集中于11—12月上市。世界柑橘加工率約為40%,主要加工產(chǎn)品年產(chǎn)量大約為1860×104t,分別為柑橘汁、橘瓣罐頭,以及柑橘糖制品果醬、果凍和蜜餞[6-7]。而我國(guó)柑橘的加工率不足10%,鮮食量超過90%。

        隨著柑橘栽培面積的擴(kuò)大,加之品種結(jié)構(gòu)不合理,柑橘上市集中,國(guó)內(nèi)缺乏大型柑橘加工企業(yè)等原因,目前國(guó)內(nèi)柑橘產(chǎn)業(yè)常常出現(xiàn)“豐產(chǎn)不豐收”,柑橘滯銷,橘農(nóng)“賣橘難”等問題,嚴(yán)重挫傷了橘農(nóng)種植積極性,在個(gè)別地方甚至出現(xiàn)了橘農(nóng)砍伐果樹的現(xiàn)象。解決我國(guó)柑橘滯銷問題,最可行的辦法就是大力發(fā)展柑橘深加工。

        鑒于此,本項(xiàng)目組開展了利用柑橘果汁發(fā)酵生產(chǎn)柑橘果酒的生產(chǎn)技術(shù)研究,但是,在柑橘果酒發(fā)酵過程中,橘子汁發(fā)酵液會(huì)出現(xiàn)極明顯的苦味,這成為了困擾柑橘果酒生產(chǎn)的難題。柑橘發(fā)酵中苦味主要來自檸檬苦素類(limonins)的作用。檸檬苦素是一種三萜類的植物次生代謝產(chǎn)物,廣泛存在于柑橘屬植物中,至今已從柑橘屬植物中分離出36種檸檬苦素類似物及17種檸檬苦素類似物配糖體[8-9]。據(jù)報(bào)道,檸檬苦素在水溶液中的苦味閾值約為1×10-6mol/L。有強(qiáng)烈苦味的檸檬苦素和諾米林酸,如果在柑橘果汁中的含量超過6mg/L,那么這種柑橘就不適合用于飲食業(yè)[10-13]。

        本實(shí)驗(yàn)利用超高效液相色譜-質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatograph-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)對(duì)柑橘果酒發(fā)酵工藝中橘汁發(fā)酵液檸檬苦素進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè),分析橘子發(fā)酵加工產(chǎn)品中苦味變化趨勢(shì),旨為柑橘果酒研制提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        漢中主產(chǎn)柑橘品種宮川,經(jīng)剝皮、榨汁、橘汁調(diào)節(jié)糖度后于發(fā)酵罐中發(fā)酵,取不同發(fā)酵階段和陳釀階段的液體為檢測(cè)材料[14-15]。

        乙腈(色譜純) 美國(guó)Burdick and Jackson 公司;娃哈哈純凈水;甲醇(分析純) 天津市登峰化學(xué)試劑廠;檸檬苦素(純度為99.8%) 天津一方科技有限公司。

        1.2 材料與儀器

        ACQUITY UPLC超高效液相色譜、ACQUITY TQD三重四極桿質(zhì)譜儀 美國(guó)Waters公司;水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司;TD24-低速臺(tái)式離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀器有限公司;AUW220D電子天平(十萬(wàn)分之一)、AUY220電子天平(萬(wàn)分之一) 日本島津公司;SK1200H超聲波清洗機(jī) 無錫市興邦基業(yè)電子有限公司;BM252C榨汁機(jī) 美的公司;全自動(dòng)生物發(fā)酵罐(7L) 上海保興生物設(shè)備工程有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 色譜條件

        ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50mm×2.5mm,1.9μm),柱溫40℃,流速0.3mL/min,進(jìn)樣5μL。流動(dòng)相為:乙腈-水(A:B)梯度洗脫,乙腈(A)梯度為0~3min(10%~50%),3~4min(50%~10%),4~5min(10%~10%)。

        1.3.2 質(zhì)譜條件

        毛細(xì)管電壓3.2kV,錐孔電壓40kV,離子源溫度110℃,脫溶劑氣溫度400℃,錐孔氣流量50L/h,脫溶劑氣流量800L/h。離子化模式為電噴霧離子源正離子模式(electrospray ionization,ESI+),碰撞池電壓30V,碰撞氬氣流速0.14mL/min。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring,MRM),檸檬苦素母離子m/z 471.1,子離子m/z 425.3、161.1。

        1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

        用AUW220D電子天平,精密稱取檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品2.85mg,用10mL乙腈溶解,超純水定容至25.0mL。制得檸檬苦素114mg/L的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照母液。

        1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

        取檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)母液0.05、0.1、0.5、1.0、2.0mL,用50%乙腈溶液定容于10mL容量瓶。得到含檸檬苦素0.57、1.14、5.70、11.40、22.80mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。在儀器設(shè)定的色譜-質(zhì)譜條件下,通過0.22μm濾膜過濾,進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)梯度樣品各5μL,以檸檬苦素母離子m/z 471.1進(jìn)行選擇,m/z 425.3為定性離子,m/z 161.1為定量離子。

        1.3.5 定量限實(shí)驗(yàn)

        將含檸檬苦素0.57μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋,在液相質(zhì)譜分析條件下進(jìn)樣分析,以RSN=10確定檸檬苦素和諾米林檢測(cè)的定量限。

        1.3.6 樣品的制備

        取3批橘子汁樣品各5L(總糖70.9g/L,總酸9.26g/L)做平行實(shí)驗(yàn),調(diào)節(jié)總糖質(zhì)量濃度到218g/L,引入葡萄酒酵母,21℃條件下在發(fā)酵罐中主發(fā)酵7d,主發(fā)酵結(jié)束后酒精度(V/V)為12.5%~13.5%(20℃),后導(dǎo)入陶罐中進(jìn)行陳釀。

        取主發(fā)酵時(shí)間為0、2、4、5、6、7d的發(fā)酵液和陳釀15、30、60、90、180d和360d的基酒進(jìn)行分析檢測(cè)。

        精密量取5.0mL橘汁發(fā)酵液于50.0mL具塞三角燒瓶中,加5.0mL乙腈,稱定燒瓶質(zhì)量。超聲處理30min,稱量燒瓶質(zhì)量,用乙腈補(bǔ)足損失質(zhì)量。4000r/min離心3min,取上清液過0.22μm微孔濾膜,待測(cè)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 檸檬苦素線性的繪制

        圖 1 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品色譜-質(zhì)譜圖Fig.1 UPLC-MS/MS chromatogram of limonin standard

        標(biāo)樣色譜圖見圖1,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。檸檬苦素線性回歸方程為:Y=62.7883X+11.245,r=0.99954。該檢測(cè)條件下,檸檬苦素在2.85~114ng之間線性關(guān)系良好。

        2.2 定量限確定

        經(jīng)實(shí)驗(yàn),在液相-質(zhì)譜分析條件下進(jìn)樣分析得到RSN=10,計(jì)算得檸檬苦素的定量檢測(cè)限為2.8ng/mL。

        2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

        取同一橘汁發(fā)酵液,按1.3.6節(jié)方法制備樣品,在色譜-質(zhì)譜條件下平行測(cè)定5次,每次進(jìn)樣5μL,測(cè)定檸檬苦素的峰面積,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。其中檸檬苦素的峰面積分別為432.1、448.2、428.5、439.8、437.6,RSD為1.73%(n=5),結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好。

        2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

        取同一橘汁發(fā)酵液,在色譜-質(zhì)譜條件下,分別在0.5、1、6、12、24h進(jìn)樣5μL檢測(cè)檸檬苦素的峰面積,分別為428.7、432.2、425.6、411.8、410.6,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,求得RSD為2.36%(n=5)。結(jié)果表明在該方法條件下,檸檬苦素24h內(nèi)穩(wěn)定。

        2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

        精密量取已測(cè)定檸檬苦素為12.46mg/L的橘汁發(fā)酵液5.0mL,加入5.7mg檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),按1.3.6節(jié)方法制備樣品條件平行制備3份,在色譜-質(zhì)譜條件下測(cè)定,計(jì)算檸檬苦素的回收率,結(jié)果如表1所示。

        表 1 回收率測(cè)定結(jié)果Table 1 Recovery rate of the UPLC- MS/MS method

        2.6 橘子汁發(fā)酵液中檸檬苦素含量

        表 2 橘汁發(fā)酵液中檸檬苦素的質(zhì)量濃度Table 2 Limonin concentration in fermented orange juice

        圖 2 橘汁發(fā)酵液檸檬苦素色譜-質(zhì)譜圖Fig.2 UPLC-MS/MS chromatogram of limonin in fermented orange juice

        橘汁發(fā)酵4d后液體中的檸檬苦素的色譜圖見圖2,平行制備3個(gè)批次的橘子汁發(fā)酵液,按1.3.6節(jié)方法進(jìn)行樣品制備,在設(shè)定的儀器條件下進(jìn)行檢測(cè)。橘汁中的檸檬苦素的含量分析結(jié)果見表2。

        圖 3 第1(A)、2(B)、3(C)批橘汁樣品中檸檬苦素變化趨勢(shì)圖Fig.3 Changes of limonin in batch 1 (A), 2 (B) and 3 (C) of fermented orange juice

        由表2顯示,橘汁在發(fā)酵過程中檸檬苦素有一個(gè)上升的過程,基本在主發(fā)酵結(jié)束時(shí)達(dá)到最高值,隨著陳釀時(shí)間的延長(zhǎng),檸檬苦素含量逐漸降低。檸檬苦素的變化趨勢(shì)如圖3所示。

        3 討論與結(jié)論

        3.1 檸檬苦素含量的測(cè)定可用于控制柑橘及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量。已報(bào)道的檢測(cè)方法很多, 主要有Davis法、分光光度法、薄層色譜法(thin layer chromatography,TLC)、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)等[8,16-18]。由于檸檬苦素類似物配糖體極性強(qiáng),在提取液中常與許多雜質(zhì)共存,因而對(duì)其檢測(cè)及純化都很困難,多數(shù)檢測(cè)方法效果不佳。對(duì)于柑橘及其加工產(chǎn)品中低含量的檸檬苦素沒有辦法進(jìn)行精確定量。本實(shí)驗(yàn)采用的UPLC-MS/MS分析方法能夠準(zhǔn)確的定量分析柑橘產(chǎn)品中的檸檬苦素,檢測(cè)限低、樣品處理簡(jiǎn)單、重復(fù)性好,能夠用于柑橘及其相關(guān)產(chǎn)品中檸檬苦素含量的分析,控制相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量。

        3.2 通常柑橘鮮食無苦味,但經(jīng)榨汁、殺菌等加工處理后就表現(xiàn)出苦味。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,柑橘發(fā)酵液有一個(gè)明顯的檸檬苦素上升的過程,該現(xiàn)象印證了橘汁產(chǎn)品的“延遲苦味”。據(jù)研究,柑橘汁出現(xiàn)“延遲苦味”的原因主要是在酸性條件和檸檬苦素D環(huán)內(nèi)酯水解酶的催化下,果實(shí)中所存在的非苦味的檸檬苦素A-環(huán)內(nèi)酯轉(zhuǎn)變成了具有強(qiáng)烈苦味的檸堿[19]。

        柑橘加工產(chǎn)品出現(xiàn)延遲苦味是柑橘加工業(yè)中比較重要的問題,避免苦味的產(chǎn)生或脫除橘汁中的苦味物質(zhì)是提高柑橘加工產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵。現(xiàn)常見的脫苦技術(shù)有吸附法、固化霉脫苦法、生物法、β-環(huán)糊精脫苦法、分離法脫苦等[20-21]。在實(shí)驗(yàn)過程中,曾采用自然沉降法,檢測(cè)苦味物質(zhì)的變化??辔段镔|(zhì)隨時(shí)間從低到高再逐漸降低,也能達(dá)到脫苦的效果,不過耗時(shí)較長(zhǎng),但對(duì)于發(fā)酵生產(chǎn)橘子果酒,長(zhǎng)時(shí)間的保存發(fā)酵液能增加產(chǎn)品的厚重感和產(chǎn)品特有風(fēng)味。

        3.3 發(fā)酵過程中發(fā)酵條件的控制也是橘汁發(fā)酵液產(chǎn)生苦味的一個(gè)重要原因。但無論如何控制條件,橘子汁發(fā)酵液中的檸檬苦素都有一個(gè)逐漸上升再到慢慢降低的過程,橘汁發(fā)酵液中檸檬苦素的這種變化趨勢(shì),將指導(dǎo)橘子酒的生產(chǎn)。取不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵液勾兌得到橘子果酒,發(fā)酵時(shí)間短的橘子果酒,苦澀味明顯,消費(fèi)者多不接受。360d(一年)后的發(fā)酵液勾兌的產(chǎn)品香味純正,具橘子特有清香、酒體橙黃、澄清透明、酸甜柔和、無明顯苦澀感,能為多數(shù)消費(fèi)者接受。采用發(fā)酵保藏時(shí)間一年以上的橘汁發(fā)酵液生產(chǎn)橘子果酒,能獲得品質(zhì)較高的橘子酒。

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