陳海濤，徐曉蘭，張 寧，孫寶國(guó)，王 鶴

(北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048)

肉味香精是一種能賦予肉制品良好風(fēng)味的食用香精，近些年來發(fā)展迅速，已廣泛應(yīng)用于方便面、膨化休閑食品及熟肉制品的調(diào)香、呈味。傳統(tǒng)的肉味香精主要是利用各種合成的單體香料經(jīng)過調(diào)香生產(chǎn)而成，很難達(dá)到與熟肉香味逼真的水平，香味單薄、口感較差[1]，所以對(duì)天然熱反應(yīng)肉味香精的研究引起了人們的高度重視。其主要是利用蛋白酶將肉類酶解為多肽和游離氨基酸等前體反應(yīng)物，再通過添加還原糖、氨基酸、油脂等熱反應(yīng)原料，在有控制的條件下加熱反應(yīng)，產(chǎn)生大量的揮發(fā)性肉類香氣物質(zhì)，香氣濃郁逼真、強(qiáng)度大[2-3]。但由于不同種類蛋白酶的作用特性和酶解條件的差異，所得的氨基酸和多肽的種類和數(shù)量也會(huì)不同，使得參與熱反應(yīng)的前體物質(zhì)不同，從而直接影響到最終熱反應(yīng)香精的風(fēng)味和強(qiáng)度[4]，因此對(duì)肉類蛋白酶解的研究具有重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)以雞胸肉為原料，選用動(dòng)物蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶，研究不同的酶解條件對(duì)水解度和所制備的雞肉香精風(fēng)味的影響，通過對(duì)酶解液參與熱反應(yīng)所得產(chǎn)物的感官評(píng)價(jià)，確定最優(yōu)酶解工藝條件，為具有雞肉香氣特征的熱反應(yīng)香精的生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞胸肉 市售。

甲醛(分析純) 成都長(zhǎng)聯(lián)化工試劑有限公司；動(dòng)物蛋白酶(30萬U/g)、木瓜蛋白酶(200萬U/g)均為食品級(jí) 南寧龐博生物工程有限公司；風(fēng)味蛋白酶(500 LAPU/g)、復(fù)合蛋白酶(1.5AU/g) 丹麥諾維信公司；葡萄糖、VB1、L-半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸 冀州市華陽化工有限責(zé)任公司；植物水解蛋白(hydrolyzed vegetable protein，HVP) 河北省保定味群食品工業(yè)有限公司；雞油 北京華都肉雞有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHSJ-4A型pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、ZNHW-Ⅱ型智能恒溫電熱套 鞏義市予華儀器有限公司；KXH101-2A 型恒溫干燥箱 上海錦屏儀器儀表有限公司；高速離心機(jī) 深圳天南海北實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 水解度測(cè)定方法[5-6]

采用甲醛電位滴定法測(cè)定上清液氨基態(tài)氮含量，凱式定氮法測(cè)定總氮含量，按照下式計(jì)算水解度。

式中：N0為總氮含量/%；N1為酶解前游離氨基態(tài)氮含量/%；N2為酶解后游離氨基態(tài)氮含量/%。

1.3.2 熱反應(yīng)香精制備方法

雞肉酶解液100g、葡萄糖8.1g、VB15.055g、半胱氨酸1.815g、甘氨酸0.374g、丙氨酸0.891g、HVP 6g、雞油3g，置于250mL四口燒瓶中，在300r/min、100℃條件下反應(yīng)90min。反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物移出，冷卻。將熱反應(yīng)香精靜置1d后，參照表1進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，考察各因素對(duì)終產(chǎn)物香氣的影響。

表 1 雞肉香精香氣評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of chicken flavoring

1.3.3 感官評(píng)價(jià)方法

由3名專業(yè)調(diào)香人員、4名肉味香精熱反應(yīng)專業(yè)人員和3名肉味香精應(yīng)用專業(yè)人員對(duì)樣品風(fēng)味進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表1所示，滿分為100分，最后取10人的平均分作為最終結(jié)果。

1.4 雞肉酶解工藝條件的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 雞肉酶解工藝流程

雞胸肉泥→加水勻漿→保溫酶解一定時(shí)間→100℃滅酶10min→冷卻→酶解液

1.4.2 預(yù)處理溫度的選擇酶解前，先對(duì)底物進(jìn)行水浴加熱30min，水浴溫度分別為60、70、80、90、100℃，然后進(jìn)行酶解，以未經(jīng)預(yù)處理的雞肉液為對(duì)照組，固定酶解條件：動(dòng)物蛋白酶、加酶量1.100‰、底物質(zhì)量比(肉和水質(zhì)量比)1：1、溫度50℃，自然pH值條件下酶解2h。做3次平行，找到最佳加熱預(yù)處理溫度。

1.4.3 單一蛋白酶酶解的選擇

分別采用動(dòng)物蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶在其各自的最適溫度下，統(tǒng)一底物質(zhì)量比1：1、加酶量1.100‰，自然pH值條件下酶解2h，測(cè)定酶解產(chǎn)物的水解度及酶解液參與熱反應(yīng)所得香精的感官評(píng)價(jià)結(jié)果。做3次平行，確定最佳單一蛋白酶。

1.4.4 蛋白酶復(fù)配酶解的選擇

1.4.4.1 最佳復(fù)配酶的選擇

將動(dòng)物蛋白酶和其他3種蛋白酶復(fù)配對(duì)雞胸肉進(jìn)行酶解，每種酶的用量均為0.550‰，底物質(zhì)量比1：1、酶解溫度50℃，自然pH值條件下酶解2h，測(cè)定酶解產(chǎn)物的水解度及酶解液參與熱反應(yīng)所得香精的感官評(píng)價(jià)結(jié)果。做3次平行，確定和動(dòng)物蛋白酶復(fù)配的最佳酶種類。

1.4.4.2 酶配比的選擇

酶解固定條件為底物質(zhì)量比1：1、酶解溫度50℃、總加酶量1.100‰，自然pH值條件下酶解2h。動(dòng)物蛋白酶和上述選出的另一種酶的復(fù)配比(質(zhì)量比)分別為3：1、2：1、1：1、1：2、1：3不同水平，測(cè)定酶解產(chǎn)物的水解度及酶解液參與熱反應(yīng)所得香精的感官評(píng)價(jià)結(jié)果。做3次平行，確定2種酶的最佳復(fù)配比。

1.4.4.3 總加酶量的選擇

酶解固定條件為底物質(zhì)量比1：1、溫度50℃，酶配比為上述選出的值，自然pH值條件下酶解2h?？偧用噶窟x擇0.275‰、0.550‰、1.100‰、1.650‰、2.200‰不同水平，測(cè)定酶解產(chǎn)物的水解度及酶解液參與熱反應(yīng)所得香精的感官評(píng)價(jià)結(jié)果。做3次平行，確定最佳總加酶量。

1.4.4.4 底物質(zhì)量比的選擇

酶解固定條件為溫度50℃，酶配比和總加酶量為上述選出的值，自然pH值條件下酶解2h。底物質(zhì)量比選擇1：2、1：1、2：1不同水平，測(cè)定酶解產(chǎn)物的水解度及酶解液參與熱反應(yīng)所得香精的感官評(píng)價(jià)結(jié)果。做3次平行，確定最佳底物質(zhì)量比。

1.4.4.5 酶解溫度的選擇

固定上述選出的最佳底物質(zhì)量比、酶配比、總加酶量，自然pH值條件下酶解2h。酶解溫度選擇45、50、55、60℃不同水平，測(cè)定酶解產(chǎn)物的水解度及酶解液參與熱反應(yīng)所得香精的感官評(píng)價(jià)結(jié)果。做3次平行，確定最佳酶解溫度。

1.4.4.6 酶解時(shí)間的選擇

固定上述選出的最佳底物質(zhì)量比、酶配比、總加酶量。酶解時(shí)間選擇1、2、3、4h不同水平，測(cè)定酶解產(chǎn)物的水解度及酶解液參與熱反應(yīng)所得香精的感官評(píng)價(jià)結(jié)果。做3次平行，確定最佳酶解時(shí)間。

1.4.4.7 加酶方式的選擇

多酶酶解時(shí)有同步水解(酶同時(shí)加入)和分步水解(酶分先后加入)兩種方式[7]。固定反應(yīng)體系的底物質(zhì)量比、加酶量、酶配比和溫度，同步水解時(shí)，將兩種酶共同加入反應(yīng)體系進(jìn)行水解一定時(shí)間；分步水解時(shí)，先加一種酶反應(yīng)一段時(shí)間后，選擇滅酶或不滅酶后，再加入另一種酶共同水解。

1.4.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝條件[8]

通過單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選擇L9(34)正交表對(duì)酶解反應(yīng)時(shí)間、加酶方式、底物質(zhì)量比以及總加酶量4個(gè)因素進(jìn)行正交優(yōu)化。因素及水平選取如表2所示。

表 2 蛋白酶酶解正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Coded value and corresponding actual values of the hydrolysis parameters used in the orthogonal array design

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理溫度的確定

圖 1 預(yù)處理溫度對(duì)水解度的影響Fig.1 Effect of pretreatment temperature on DH of chicken

由圖1可知，經(jīng)過熱處理后，水解度不但沒有增加反而降低了，這可能是由于熱變性溫度過高或時(shí)間過長(zhǎng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)過度聚合，生成分子締合物，造成蛋白質(zhì)過度熱變性，從而降低水解度[9]。所以，本實(shí)驗(yàn)不采用加熱預(yù)處理。

2.2 單一蛋白酶酶解的選擇

肉香味形成的主要原理是氨基酸和各種羰基化合物之間的“羰氨反應(yīng)”，即美拉德反應(yīng)[10]，因此氨基酸的組成對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的香氣影響很大。但由于各種蛋白酶的作用位點(diǎn)不同，酶解所得的多肽和氨基酸的種類和含量也會(huì)不同[11]，因此蛋白酶的選擇對(duì)于香精香氣的形成非常重要。

表 3 單一酶對(duì)水解度及產(chǎn)物香氣的影響Table 3 Effect of different proteases, when used singly, on sensory aroma score of chicken flavoring

由表3可知，相同酶解時(shí)間下，木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度最大，其次是中性蛋白酶，再次是動(dòng)物蛋白酶，而風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度最小，這可能與木瓜蛋白酶的內(nèi)切酶特性和風(fēng)味酶的外切酶特性有關(guān)，內(nèi)切酶可以直接作用于蛋白質(zhì)肽鏈的中間位點(diǎn)，而外切酶只有從蛋白質(zhì)肽鏈的兩端酶解，由于缺乏足夠多的端點(diǎn)，風(fēng)味酶酶解產(chǎn)物的水解度較低[12-13]。但是從酶解液參與熱反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)上看，動(dòng)物蛋白酶的酶解液參與熱反應(yīng)得分最高、香氣最佳，而木瓜蛋白酶有生腥味，香氣不協(xié)調(diào)。因此，綜合考慮，選定動(dòng)物蛋白酶為最佳單酶。但從整體上說，經(jīng)單酶酶解的所有熱反應(yīng)產(chǎn)物的肉香都不夠突出，逼真性不好，可能是由于單酶酶解的位點(diǎn)比較單一，不利于熱反應(yīng)底物短肽及氨基酸的形成，因此，考慮將動(dòng)物蛋白酶和其他3種單酶進(jìn)行復(fù)配酶解。

2.3 蛋白酶復(fù)配酶解的選擇

2.3.1 最佳復(fù)配酶的選擇

表 4 復(fù)配酶的種類對(duì)水解度及產(chǎn)物香氣的影響Table 4 Effect of comblnations of anima-derived protease with another protease on sensory aroma score of chicken flavoring

將表4和表3對(duì)比發(fā)現(xiàn)，雙酶復(fù)配酶解比單一酶酶解的效果好。首先，水解度方面有了較明顯的提高，說明雙酶復(fù)配后使酶切位點(diǎn)增多，更加有利于雞肉的酶解。另外，利用雙酶復(fù)配制備的酶解液參與熱反應(yīng)得到的產(chǎn)物香氣明顯優(yōu)于單酶酶解，尤其是動(dòng)物蛋白酶和復(fù)合蛋白酶復(fù)配時(shí)，所得產(chǎn)物肉味突出且特征香味明顯。因此，選擇動(dòng)物蛋白酶和復(fù)合蛋白酶作為復(fù)配的2種蛋白酶。

2.3.2 酶配比的選擇

由圖2可知，水解度方面，隨著動(dòng)物蛋白酶含量的減少，水解度曲線先下降后上升，上升到一定程度又下降，當(dāng)動(dòng)物蛋白酶與復(fù)合蛋白酶的復(fù)配比為1：2時(shí)水解效果最好，1：1時(shí)次之；在香氣評(píng)價(jià)方面，在酶配比為1：1時(shí)，所得最終熱反應(yīng)產(chǎn)物肉感飽滿且香氣濃郁，得分最高，而1：2時(shí)的最終熱反應(yīng)產(chǎn)物雖有一定的肉香味，但雞肉特征香氣不明顯，在酶配比為3：1時(shí)，所得最終產(chǎn)物有肉腥味，2：1和1：3時(shí)有異味，得分低。綜合考慮，選擇動(dòng)物蛋白酶和復(fù)合蛋白酶的酶配比為1：1。

圖 2 酶配比對(duì)水解度及產(chǎn)物香氣的影響Fig.2 Effect of animal-derived protease/protamex ratio on DH of chicken and sensory aroma score of chicken fl avoring

2.3.3 總加酶量的選擇

圖 3 總加酶量對(duì)水解度及產(chǎn)物香氣的影響Fig.3 Effect of total enzyme dosage on DH of chicken and sensory aroma score of chicken fl avoring

由圖3可知，隨著總加酶量的增加，水解度越來越大，這可能是由于加酶量處于0.275‰～2.200‰范圍內(nèi)時(shí)，增加的酶量相對(duì)于底物質(zhì)量比來說并未飽和，隨著加酶量的增大，反應(yīng)速度越來越快，蛋白質(zhì)水解率也越來越高[14-15]。但從熱反應(yīng)產(chǎn)物香氣評(píng)分上看，當(dāng)加酶量由0.275‰增加到0.550‰時(shí)，香氣得分呈上升趨勢(shì)，但加酶量超過0.550‰后，隨著酶量的增加香氣得分反而逐漸下降，其中，加酶量為0.550‰時(shí)有濃郁的肉香和脂香且香氣協(xié)調(diào)度好，加酶量為1.650‰時(shí)出現(xiàn)了輕微的糊味而影響了整體的協(xié)調(diào)度，加酶量為2.200‰時(shí)則出現(xiàn)了較明顯的苦味，這可能與水解出一定量的苦味肽有關(guān)。綜合考慮，選擇總加酶量為0.550‰。

2.3.4 底物質(zhì)量比的選擇

圖 4 底物質(zhì)量比對(duì)水解度及產(chǎn)物香氣的影響Fig.4 Effect of substrate/water ratio on DH of chicken and sensory aroma score of chicken fl avoring

由圖4可知，隨著底物中肉含量的增加，水解度呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，這說明在酶量固定的情況下，在一定范圍內(nèi)，隨著肉含量的增加，可水解的蛋白質(zhì)底物增多，水解度不斷上升。從熱反應(yīng)產(chǎn)物香氣評(píng)分上看，肉水質(zhì)量比為1：1時(shí)香氣評(píng)分最高，所得的產(chǎn)物香氣濃郁，給人愉悅的感覺，而1：2時(shí)有雞湯味，但稍有腥味，2：1時(shí)肉香較好，但留香時(shí)間短。綜合考慮，選擇底物質(zhì)量比為1：1。

2.3.5 酶解溫度的選擇

圖 5 酶解溫度對(duì)水解度及產(chǎn)物香氣的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on DH of chicken and sensory aroma score of chicken fl avoring

在蛋白質(zhì)酶解反應(yīng)中，溫度是重要參數(shù)之一。它從兩個(gè)方面影響酶解反應(yīng)的效率[16]：1)影響蛋白酶催化反應(yīng)的速度；2)影響蛋白酶的穩(wěn)定性。由圖5可知，當(dāng)溫度在45～50℃范圍內(nèi)時(shí)，水解度和香氣評(píng)分都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而在50～60℃范圍內(nèi)時(shí)，水解度和香氣評(píng)分都呈現(xiàn)相似的下降趨勢(shì)，說明溫度超過一定值后，酶活力會(huì)很快喪失，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性下降，從而導(dǎo)致水解度的下降，故此酶解的溫度選為50℃。

2.3.6 酶解時(shí)間的選擇

圖 6 酶解時(shí)間對(duì)水解度及產(chǎn)物香氣的影響Fig.6 Effect of hydrolysis time on DH of chicken and sensory aroma score of chicken fl avoring

由圖6可知，酶解時(shí)間在1～3h內(nèi)，水解度的增速很快，3～4h內(nèi)增速趨于平緩。從熱反應(yīng)產(chǎn)物香氣評(píng)分上看，1～3h內(nèi)香氣越來越濃郁，特征香越來越明顯，而3～4h內(nèi)香氣質(zhì)量開始下降，這可能是由于反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，美拉德反應(yīng)產(chǎn)生一些短肽類的苦味物質(zhì)[17-20]。綜合考慮將酶解時(shí)間定在3h為宜。

2.3.7 加酶方式的考察

表 5 加酶方式對(duì)水解度及產(chǎn)物香氣的影響Table 5 Effect of different modes of enzymatic hydrolysis on DH of chicken and sensory aroma score of chicken flavoring

由表5可知，不同的加酶方式對(duì)酶解產(chǎn)物的水解度和酶解物參與熱反應(yīng)的效果都產(chǎn)生了較大的影響，其中，先加復(fù)合蛋白酶50℃酶解1.5h后，不滅酶，再加入動(dòng)物蛋白酶50℃酶解1.5h條件下制備的酶解液的水解度較高，而且制備的熱反應(yīng)產(chǎn)物雞肉香味飽滿、圓潤(rùn)，逼真性好，因此，選定該加酶方式。

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝條件

表 6 蛋白酶酶解正交試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Orthogonal array design matrix with sensory aroma score of chicken flavoring

由表6可知，對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析可得，極差大小順序?yàn)镽C＞RA＞RB＞RD，所以各因素從主到次的順序?yàn)椋篊(底物質(zhì)量比)＞A(酶解溫度)＞B(加酶方式)＞D(總加酶量)，最優(yōu)方案為C3A2B1D3，即底物質(zhì)量比為1：1、酶解溫度50℃、加酶方式1h：2h(復(fù)合蛋白酶酶解1h后，不滅酶，加入動(dòng)物蛋白酶再酶解2h)、總加酶量1.100‰。在此酶解條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到雞肉蛋白的水解度為20.47%，所得的酶解液參與熱反應(yīng)制備的雞肉香精肉感飽滿、香氣突出、留香時(shí)間長(zhǎng)、整體協(xié)調(diào)度好，香氣評(píng)分95分。

3 結(jié) 論

3.1 雞肉酶解時(shí)酶的選擇對(duì)于熱反應(yīng)香精的香氣有很重要的影響，利用動(dòng)物蛋白酶和復(fù)合蛋白酶進(jìn)行復(fù)配酶解，所得的酶解液參與熱反應(yīng)制備的產(chǎn)物香氣較好。

3.2 通過單因素試驗(yàn)，對(duì)影響酶解過程的多個(gè)因素進(jìn)行研究，初步得出酶解工藝各因素的適宜條件，然后在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交優(yōu)化，得出對(duì)熱反應(yīng)雞肉香精香氣影響較大的4個(gè)因素的主次關(guān)系是：底物質(zhì)量比＞酶解溫度＞加酶方式＞總加酶量。

3.3 正交得到最優(yōu)的酶解條件為：底物質(zhì)量比為1：1、酶解溫度50℃、加酶方式1h：2h(復(fù)合蛋白酶酶解1h后加入動(dòng)物蛋白酶共同酶解2h)、總加酶量1.100‰，此時(shí)的水解度可達(dá)20.47%，制備的雞肉香精肉香突出，仿真度高。

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