陳季旺，劉珊珊，蔡廣霞，吳永寧,2

(1.武漢工業(yè)學院食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023；2.中國疾病預防控制中心營養(yǎng)與食品安全所，北京 100050)

高血壓會造成腦、心、腎等重要器官損害，導致中風等，已成為一個嚴重的社會公共衛(wèi)生問題。在發(fā)達國家，高血壓患病率高達25%以上，在發(fā)展中國家，近年來其患病率也在不斷增長。預計到2025年，全世界高血壓病人將達到1.5億人[1]。在高血壓人群中95%以上患者是原發(fā)性高血壓，通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensinⅠ-converting enzyme，ACE)活性可降低原發(fā)性高血壓[2]。食物源ACE抑制肽在溫和條件下由蛋白酶水解蛋白質(zhì)獲得，其食用安全性高，無毒副作用；對高血壓患者具有降壓效果，對血壓正常者無降壓作用；它同時具有減肥、免疫調(diào)節(jié)等功能，有著化學合成ACE抑制劑不可比擬的優(yōu)越性，其良好的安全性能以及多種生理功能吸引了眾多的研究者[3]。

1979年Oshima等[4]報道了第一個從食物蛋白質(zhì)中獲得的ACE抑制肽。隨后從乳蛋白[5]、雞蛋蛋白[6]、油料蛋白[7]、谷物蛋白[8]、魚蛋白[9]等中分離純化了大量的ACE抑制肽。定量構效關系(quantitative structure-activity relationship，QSAR)研究是從一系列已知化合物中找出結構和生物學活性之間的數(shù)量依賴關系，建立數(shù)學模型，用這種數(shù)學模型可以預測新化合物的活性，并為指導和設計新化合物提供理論依據(jù)，因此對ACE抑制肽進行QSAR研究有助于深入理解肽的結構特征以及活性機理[10-11]。ACE 抑制肽的分子結構表征在QSAR 研究中非常關鍵，通常以物理化學參數(shù)如電性、立體和疏水等來表征結構。Hellberg等[12]首先以氨基酸側(cè)鏈為基礎，從29種物化參數(shù)中提取氨基酸殘基的疏水性、立體性質(zhì)、電荷性質(zhì)3個主要參數(shù)來表征多肽結構特征。隨后，許多研究者對ACE抑制肽結構與活性關系進行了研究，發(fā)現(xiàn)了多種潛在的ACE抑制肽和食物源[13-17]。Majumder等[18]報道采用QSAR模型預報了3種新的來源于雞蛋蛋白的ACE抑制三肽，并通過QSAR模型證明牛奶、禽肉、雞蛋、大豆等是良好的ACE抑制肽來源[11]。

從已報道的ACE抑制肽的QSAR模型發(fā)現(xiàn)，這些模型對肽的活性預測、解釋能力有限，且預測結果與實測值差異較大。本實驗在上述研究的基礎上，收集近年發(fā)現(xiàn)的ACE抑制三肽，以單個氨基酸側(cè)鏈的疏水值、立體性質(zhì)、電性參數(shù)為自變量，三肽的lg(IC50)為因變量，利用偏最小二乘回歸法(partial least squares regression，PLS)研究ACE抑制三肽的QSAR，建立數(shù)學模型，并采用“留一法”進行交叉驗證，闡明三肽結構與ACE抑制活性的QSAR，并對已知氨基酸序列三肽的ACE抑制活性進行預測和驗證，擬為獲得高活性的ACE抑制肽提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

收集近年發(fā)現(xiàn)的ACE抑制三肽及其IC50值作為模型樣本，對于不同來源的相同肽序列，報道的IC50值有差異，本實驗優(yōu)選較佳的IC50值，使得建立的模型具有準確性。得到101個三肽的IC50值。因IC50值的相差倍數(shù)較大，為改善分析結果，采用lg(IC50)進行數(shù)據(jù)分析。

1.2 數(shù)據(jù)處理與模型構建

根據(jù)Hellberg等[12]提出的20個天然氨基酸描述符Z-scales，從描述20個天然氨基酸的29種物化參數(shù)中，運用主成分分析法，分別提取與氨基酸的疏水性(Z1)、立體性質(zhì)或者側(cè)鏈氨基酸的分子大小(Z2)和電性(Z3)有關的3個參數(shù)作為自變量(表1)。模型構建(表2)以肽的lg(IC50)為因變量，引入肽的疏水性質(zhì)參數(shù)為X1(計算方法參考文獻[19]等)，N端第一個氨基酸的疏水性、空間屬性和電性參數(shù)分別為自變量X2、X3、X4，N端第二個氨基酸的疏水性、空間屬性和電性參數(shù)分別為自變量X5、X6、X7，以此類推。運用PLS對多重自變量和因變量進行多元回歸分析，建立QSAR模型。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SIMCA-P 12.0軟件在PC上完成。

表 1 20種天然氨基酸的物理化學參數(shù)[12]Table 1 Physico-chemical parameters of twenty natural amino acids[12]

表 2 101個三肽ACE抑制活性及Z-scales描述值Table 2 ACE inhibitory activity and Z-scales of 101 tripeptides

續(xù)表2

續(xù)表2

1.3 樣本數(shù)據(jù)共線性分析

使用多元線性回歸建模時必須要對自變量進行多重共線性檢測，診斷自變量系統(tǒng)中是否確實存在多重相關性[20]。較為常見的診斷方法[21]是使用方差膨脹因子(VIF)，若VIF≥10，表示多重共線性將嚴重影響回歸結果的穩(wěn)定性和可靠性。采用Stata 11.0軟件分別計算ACE抑制三肽自變量的方差膨脹因子(VIF)，對各自變量進行共線性診斷。

1.4 模型優(yōu)化與ACE抑制三肽的QSAR分析

對所采集的101樣本，10個自變量，1個自變量采用PLS建立數(shù)學模型，分析模型方程的標準回歸系數(shù)，剔除對因變量影響不顯著的自變量，重新建立數(shù)學模型，得到優(yōu)化的較佳模型，分析影響ACE抑制三肽活性的關鍵因素及其作用效果，探討氨基酸序列與ACE抑制三肽活性之間的關系。

1.5 模型的檢驗與預測

為考察模型的穩(wěn)定性和預測能力，對建立的模型用“留一法(leave-one-out)”分別作交互檢驗(cross validation，CV)，既每次從樣本集中抽出一個肽，用其余的三肽建模并預測抽出的三肽的IC50值，得到各肽的IC50預測值，計算交叉驗證相關系數(shù)Q2。

Q2=1－∑(yexp－ypre)2/∑(yexp－yave)2

式中：yexp表示實際測得的活性值；ypre表示交叉驗證的活性預測值；yave表示所有肽平均活性值。

根據(jù)所建立模型對本課題組分離所得的VNP(Val-Asn-Pro)[23]、VWP(Val-Trp-Pro)[23]和VAP(Val-Ala-Pro)[24]的IC50值進行預測，比較實測值與預測值的差異，驗證模型的預測能力。

2 結果與分析

2.1 自變量共線性診斷

采用Stata 11.0軟件計算三肽10個自變量的方差膨脹因子(VIF)，對各自變量進行共線性診斷。由表3可知，三肽樣本集中10個自變量的VIF值在1～4之間，均小于10，表明樣本自變量共線性不高，對回歸模型結果的穩(wěn)定性和可靠性影響較小，因此該樣本變量的選取可靠。采用PLS方法建立ACE抑制三肽的QSAR模型。

2.2 PLS模型初步建立

以收集的101個ACE抑制三肽中單個氨基酸側(cè)鏈的疏水性、立體性質(zhì)、電性參數(shù)和肽的總體疏水性等10個自變量為自變量，以三肽的lg(IC50)值為因變量，利用PLS研究ACE抑制三肽的QSAR，建立三肽的結構與ACE抑制活性關系的QSAR模型方程，該方程10個自變量和1個因變量的回歸方程標準回歸系數(shù)值見表4。

表 4 初始模型標準回歸系數(shù)Table 4 PLS standard regression coeff icients of the initial model

由表4可知，自變量X1、X4、X6的標準回歸系數(shù)絕對值均小于0.05，對模型的影響不顯著，可解釋ACE抑制三肽的總體疏水參數(shù)、第一位氨基酸的電荷性質(zhì)、第二位氨基酸的立體性質(zhì)對因變量lg(IC50)的影響較小，可以剔除該自變量以進一步優(yōu)化模型。

2.3 模型優(yōu)化與構效關系分析

在第一步模型的基礎上，剔除影響不顯著的自變量后，重新采用PLS方法建立模型方程，其標準化回歸方程為：

將標準化變量表示為原變量回歸方程為：

樣本數(shù)101，R2(X)為0.729，R2(Y)為0.727，該模型對自變量X的解釋能力為0.729，對因變量Y的解釋能力為0.727，表明該模型對樣本集具備良好匹配性。該模型同比Wu Jianping等[15]報道采用140樣本建立的三肽模型(R2=0.4706)更精確。所得模型的自變量標準回歸系數(shù)圖見圖1。由回歸模型的相關系數(shù)可知，X2、X3、X5、X7、X8與三肽的lg(IC50)正相關，X9、X10與其負相關，且X8、X2即末、首位氨基酸的疏水值及X7中間氨基酸的電性參數(shù)對三肽的ACE抑制活性影響最大。X2、X5、X8即組成肽的單個氨基酸疏水值越小(如Val、Lys)，該肽的ACE抑制活性越高。X7即中間氨基酸的電性參數(shù)對ACE抑制活性影響較大，呈正相關，而X10即末端氨基酸的電性參數(shù)對ACE抑制活性呈負相關。X3、X9即首、末位氨基酸的體積參數(shù)對ACE抑制活性亦有較大影響。由模型可得，對于ACE抑制三肽的結構組成，具較低疏水值、體積參數(shù)的氨基酸如Val、Leu和Ile傾向于處于N端第一位，較高疏水值和較低電性參數(shù)的氨基酸如Lys、Arg傾向于第二位，較低疏水值和較高體積、電性參數(shù)的氨基酸如Pro、Phe等傾向于第三位。

圖 1 PLS 標準回歸系數(shù)直方圖Fig.1 Histogram of PLS standard regression coeff icients

Cheung等[22]對ACE抑制三肽的構效關系分析表明：C端為芳香族氨基酸且N端為支鏈氨基酸的三肽具有較高的活性。黎觀紅[13]以及Wu Jianping[15]等研究表明ACE抑制活性高的三肽C末端的氨基酸多為芳香族氨基酸，N端氨基酸多為疏水性氨基酸。但中間位置氨基酸分析各異，黎觀紅[13]指出中間位置的氨基酸傾向于電荷指數(shù)、側(cè)鏈體積和疏水性較小的氨基酸，Wu Jianping等[15]報道中間位置的氨基酸為電荷指數(shù)小而側(cè)鏈體積和疏水性大的氨基酸。本研究的QSAR結果中C端與N端氨基酸組成基本與報道一致，但模型表明中間位置氨基酸的體積參數(shù)對模型的影響不大，主要為電荷性質(zhì)的影響，即較高疏水值和較低電性參數(shù)的氨基酸傾向于第二位如Lys、Arg。

2.4 QSAR模型的檢驗

為了考察模型的穩(wěn)定性和預測能力，對建立的模型用“留一法”做交叉檢驗，計算整理出101個三肽ACE抑制活性的預測值，計算交叉驗證相關系數(shù)Q2為0.549(Q2大于0.5表明模型具有較好的預測能力[15])。將三肽ACE抑制活性的預測值和實驗值作圖。由圖2可知，模型的預測值和實驗值具有較好的線性關系(R2=0.7250)，表明該模型具有良好的預測能力。

圖 2 101個ACE 抑制三肽lg(IC50)實驗值與預測值的相關圖Fig.2 Plot of experimental lg (IC50) versus predicted lg (IC50) of 101 ACE inhibitory tripeptides

2.5 QSAR模型的預測

QSAR模型預測包括高活性ACE抑制三肽源的發(fā)現(xiàn)和已知三肽序列活性的預測。綜合上述模型的分析和檢驗，該模型具有良好的匹配度和預測能力，可以利用其尋找具有較高ACE抑制活性的肽序列或預測ACE抑制活性，為后續(xù)的化學合成、體內(nèi)實驗提供參考。利用建立的模型對本課題組分離純化得到的VNP、VWP和VAP的IC50值進行預測，并與實際測定值進行比較，驗證模型的預測能力。

表 5 ACE抑制三肽活性預測值與實測值比較Table 5 Comparison of predicted and experimental IC50 of ACE inhibitory tripeptides

在該模型樣本范圍內(nèi)，所選取的101個ACE抑制三肽lg(IC50)所有預測值和實測值的誤差值均小于1個單位值。由表5可知，利用該模型對3種新發(fā)現(xiàn)的ACE抑制三肽的lg(IC50)進行預測，實測值和誤差值在0.06～0.23之間，符合該模型檢測范圍，且對VWP的誤差值最小僅為0.06，對VNP誤差值最大為0.23。該結果進一步驗證了模型的預測能力。

3 結 論

以采集ACE抑制三肽的氨基酸側(cè)鏈的疏水性質(zhì)、立體性質(zhì)、電荷性質(zhì)參數(shù)及三肽的總疏水參數(shù)為自變量，三肽的lg(IC50)為因變量，采用PLS方法建立三肽的組成和ACE抑制活性關系的初始數(shù)學模型，剔除對因變量影響不顯著的X1、X4、X6指標，得到優(yōu)化的QSAR模型的回歸方程為：Y=1.952+0.1229X2+ 0.0924X3+ 0.0425X5+0.1777X7+ 0.136X8－0.0809X9－0.1763X10。

樣本數(shù)101，R2(X)為0.729，R2(Y)為0.727，Q2為0.549。該模型對自變量X的解釋能力為0.729，對因變量Y的解釋能力為0.727，表明該模型對樣本集具備良好匹配性。Q2為0.549大于0.5，表明模型具有較好的預測能力。

對模型的分析結果表明：X8、X2即末、首位氨基酸的疏水值及X7中間氨基酸的電性參數(shù)對三肽的ACE抑制活性影響最大。X2、X5、X8即組成肽的各氨基酸疏水值越小(如Val、Leu)，該肽的ACE抑制活性越高。X7即中間氨基酸的電性參數(shù)對ACE抑制活性呈正相關，而X10即末端氨基酸的電性參數(shù)對ACE抑制活性呈負相關。對于ACE抑制三肽，具較低疏水值、體積參數(shù)的氨基酸如Val、Leu和Ile傾向于處于N端第一位，較低疏水值、電荷參數(shù)如Lys和Arg傾向于第二位，較低疏水值和較高體積參數(shù)、電荷參數(shù)如Pro、Phe等傾向于第三位。利用該模型預測新發(fā)現(xiàn)的ACE抑制三肽VNP、VWP和VAP，結果表明3種ACE抑制三肽實測值和誤差值在0.06～0.23之間，均在模型樣本誤差范圍內(nèi)，進一步驗證該模型具備的良好預測能力。

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