陳 靜，郝偉偉，王春梅，陳 惠,*，吳 琦，韓學易

(1.四川農(nóng)業(yè)大學生命科學與理學院，四川 雅安 625014；2.四川省華派生物制藥有限公司，四川 簡陽 641401)

β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)又稱纖維二糖酶，屬于纖維素酶類，是一種能催化水解芳基或烴基與糖基原子團之間的糖苷鍵生成葡萄糖的酶[1]。作為纖維素酶水解纖維素過程中最后一步關(guān)鍵酶，把纖維二糖和短鏈的纖維寡糖分解為可利用的葡萄糖[2-3]。在水果、蔬菜、茶葉中，除含有萜烯醇類香氣物質(zhì)外，還有大量以無香味非揮發(fā)性的前體物——β-糖苷(單萜烯基-β-D-葡萄糖苷)的形式存在，β-葡萄糖苷酶能將其水解為具有濃郁天然風味的香氣物質(zhì)，以改良在加工、貯藏過程中對風味的影響。另外，β-葡萄糖苷酶可與其他風味酶協(xié)同作用釋放出揮發(fā)性糖苷配基，起到增香作用，從而提高果汁品天然風味[4-6]。β-葡萄糖苷酶也可應(yīng)用于生產(chǎn)低聚龍膽糖，低聚龍膽糖比麥芽糖漿具有更高的吸水性和較低的黏度，使食物中淀粉不易被老化；它不易被人體纖維素酶消化，并對雙歧桿菌有增殖作用，可用于咖啡制品和巧克力制品中起味覺改良作用[7]。目前，食品工業(yè)中大多采用風味添加劑來增加食品的風味，β-葡萄糖苷酶可作為一種更健康更安全的食品添加劑。

1837年，β-葡萄糖苷酶首次在苦杏仁中發(fā)現(xiàn)。后經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，β-葡萄糖苷酶普遍存在于如茶樹這類植物[8]及白蟻、蚯蚓、螞蟻這類昆蟲中[9]，另外在酵母、曲霉及細菌體內(nèi)也廣泛存在。目前，國內(nèi)外用于研究的生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的微生物大多屬于真菌，因為真菌和細菌以及放線菌相比較，真菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶多為胞外酶，分離純化都更為方便，適用于固體培養(yǎng)和液體深層發(fā)酵。這為酶制劑的生產(chǎn)提供了有利的條件，也為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。但β-葡萄糖苷酶的酶活力普遍很低，產(chǎn)量不高。因此，尋找一種新的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶真菌是極其必要的。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

雅安市周公山海拔1500m處腐殖質(zhì)土壤。

1.2 培養(yǎng)基

1)富集培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.4g、MgSO4·7H2O 0.05g、NaCl 0.2g、CaCO30.4g、KH2PO40.1g、纖維二糖0.5g、鏈霉素適量。2)初篩培養(yǎng)基(馬丁氏培養(yǎng)基)：KH2PO41g、MgSO4·7H2O 0.5g、蛋白胨10g、葡萄糖10g、瓊脂15～20g，用蒸餾水定容至1000mL，此培養(yǎng)液1000mL加1%孟加拉紅水溶液3.3mL滅菌待用。3)復(fù)篩培養(yǎng)基(剛果紅CMC-Na瓊脂培養(yǎng)基)[10]：蛋白胨1g、酵母粉1g、CMC-Na 1g、NaCl0.5g、KH2PO40.1g、剛果紅 0.02g、瓊脂1.6g，蒸餾水定容至100mL，pH值自然。4)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基[11]：麥麩粉2.0g、蛋白胨0.2g、Mandels無機鹽營養(yǎng)液50mL。5) LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%、NaCl 1%、酵母粉0.5%，pH7.0～7.5；配制固體培養(yǎng)基時需加入1.6%的瓊脂粉。6) LB-Amp培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入100μg/mL的氨芐青霉素鈉。

1.3 方法

1.3.1 菌株篩選

1.3.1.1 富集

稱取5g土樣至無菌三角瓶中，加入10倍無菌水振蕩混勻，取5mL懸浮液于50mL富集培養(yǎng)基中，30℃、180r/min培養(yǎng)48h。

1.3.1.2 平板初篩

將富集后的培養(yǎng)液按10-2、10-3、10-4、10-5共4個梯度稀釋，各取400μL涂布于初篩培養(yǎng)基上，30℃倒置恒溫培養(yǎng)，直至出現(xiàn)單菌落。

1.3.1.3 平板復(fù)篩

將單菌落轉(zhuǎn)接至剛果紅CMC-Na瓊脂培養(yǎng)基上，30℃倒置恒溫培養(yǎng)96h，挑選有透明水解圈的菌落繼續(xù)于剛果紅CMC-Na瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，得到純培養(yǎng)。

1.3.1.4 菌種保存

保存純培養(yǎng)的菌株于PDA斜面培養(yǎng)基中，待進一步篩選。

1.3.1.5 酶活力測定

各挑取一環(huán)已篩選到的菌株于10mL發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30℃、180r/min培養(yǎng)24h后，分別轉(zhuǎn)接5mL種子液于50mL(250mL三角瓶)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30℃、180r/min培養(yǎng)96h。將發(fā)酵液于4℃、4000r/min離心10min，取上清測定β-葡萄糖苷酶酶活力[12]。

酶活力單位定義：1mL酶液在lmin內(nèi)使底物產(chǎn)生1μmol還原糖(以葡萄糖計)所需的酶量為1個酶活力單位(U)。

1.3.2 菌株鑒定

1.3.2.1 菌株形態(tài)觀察

在PDA固體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)3d，觀察其外部形態(tài)；采用插片培養(yǎng)法，顯微鏡下觀察菌絲體形狀、大小，孢子大小、形狀、類型、顏色。

1.3.2.2 菌株分子生物學鑒定

采用r D N A I T S 基因序列分析，以提取的真菌的總DNA[13]為模板，采用ITS通用引物(ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCT-3’；ITS4：5’-TCCTCCGC TTATTGATATGC-3’)通過PCR擴增其ITS序列，反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性5min；95℃變性45s，50℃退火45s，72℃延伸2.5min，30個循環(huán)；72℃延伸5min。

PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，用Omega公司膠回收試劑盒回收目的DNA片段，DNA片段與pMD19-T Vector連接，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆送至北京諾賽生物技術(shù)有限公司測序。將測序結(jié)果通過BLAST程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進行比對分析，選取同源性高的模式菌株的ITS rDNA序列，利用Clustal X和MEGA 4.0軟件進行多序列比對，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 酶的分離純化

發(fā)酵液經(jīng)離心去沉淀，上清液用飽和度為60%的飽和硫酸銨沉淀，置于4℃，靜置12h后，4℃、5000r/min離心10min，去上清。用醋酸鹽緩沖液(pH4.8)溶解沉淀，溶解后的酶溶液放入透析袋經(jīng)透析除鹽，用Ba2+檢驗是否鹽離子已除盡，使用聚乙二醇20000將酶溶液濃縮至1～2mL。上經(jīng)20mmol/L、pH 4.8醋酸緩沖液平衡好的Sephadex G-100柱(45.0cm×Φ3.5cm)，用平衡緩沖液洗脫，流速為1mL/min，每管收集3mL。收集活性峰，用透析袋除鹽，聚乙二醇20000濃縮。在上以20mmol/L、pH4.8醋酸緩沖液預(yù)先平衡的DEAE Cellulose 52弱陰離子交換柱(28.0cm×Φ3.0cm)，把20mmol/L、pH4.8醋酸緩沖液和0.5mol/L NaCl溶液分別置于磁力攪拌梯度混合器的A、B容器，形成0～0.5mol/L NaCl溶液，進行梯度洗脫，流速為1mL/min，每管收集3mL。收集活性峰，以透析袋除鹽，聚乙二醇20000濃縮，放置4℃中保存，用于酶學性質(zhì)研究。

1.3.4.1 蛋白含量測定

采用考馬斯亮藍G-250法測定。

1.3.4.2 β-葡萄糖苷酶酶活力測定

按1.3.1.5節(jié)所提方法進行測定[12]。

1.3.4.3 酶分子質(zhì)量測定

采用SDS-PAGE法，4%濃縮膠，12%分離膠。

1.3.5 酶學性質(zhì)分析

臘肉是一種腌制食品，具有較強的防腐能力，能長時間保存。壯族人喜歡制作和食用臘肉，每到春節(jié)前夕，各家各戶都將剛宰殺好的新鮮豬肉制作成臘肉。對于住在偏遠山區(qū)且條件艱苦的人們來說，臘肉既方便又實惠，逢年過節(jié)或招待客人時買些新鮮肉類配合臘肉，平時的葷食常以臘肉為主。

1.3.5.1 最適反應(yīng)溫度的測定

將適當稀釋的酶液0.5mL與0.5mL水楊苷(0.5g/100mL、pH4.8)分別在30、40、50、60、70、80、90℃環(huán)境下反應(yīng)20min，并測定各組酶活力。

1.3.5.2 熱穩(wěn)定性的測定

將適當稀釋的酶液分別在30、40、50、60、70、80、90℃環(huán)境下保溫1h，取0.5mL與0.5mL水楊苷(0.5g/100mL、pH4.8)混合，于55℃環(huán)境下反應(yīng)20min，并測定各組酶活力。

1.3.5.3 最適反應(yīng)pH值的測定

將適當稀釋的酶液0.5mL與0.5mL 0.5g/100mL pH值分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的水楊苷在55℃反應(yīng)20min，測定各組酶活力。

1.3.5.4 pH值穩(wěn)定性的測定

將酶液用pH值分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的緩沖液稀釋一定倍數(shù)，放置1h后，調(diào)節(jié)pH值至7.0，取0.5mL與0.5mL水楊苷(0.5g/100mL、pH4.8)在55℃反應(yīng)20min，測定各組酶活力。

1.3.5.5 金屬離子對β-葡萄糖苷酶活力的影響

粗酶液用含1mmol/L的K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Mn2+、Ba2+、Fe3+、Fe2+、Zn2+、Li+、Ag+、Cu2+、Co2+醋酸緩沖液(0.1mol/L、pH4.8)稀釋到一定倍數(shù)，以不加金屬離子的緩沖液為空白對照。取0.5mL與0.5mL水楊苷(0.5g/100mL、pH4.8)在55℃反應(yīng)20min，測定各組酶活力。

1.3.5.6 β-葡萄糖苷酶活力底物特異性

分別以羧甲基纖維素、微晶纖維素、纖維二糖、水楊苷為底物，溶解于0.1mol/L pH4.8醋酸緩沖液中為底物，質(zhì)量濃度為0.5g/100mL。將適當稀釋的酶液0.5mL與0.5mL底物緩沖液在55℃反應(yīng)20min，測定各組酶活力。

1.3.5.7 動力學參數(shù)

將底物纖維二糖和水楊苷終濃度分別分別調(diào)到0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L，按酶活力測定方法測定還原糖以計算酶反應(yīng)的初速率。以底物濃度的倒數(shù)(1/[S])為橫坐標，酶反應(yīng)初速率的倒數(shù)(1/[V])為縱坐標，作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選

經(jīng)剛果紅染色后，得到3株有透明光圈的菌株，命名為giF-2、giF-7、giF-10。經(jīng)測定，其酶活力分別為0.903、0.714、2.522U/mL，其中菌株giF-10產(chǎn)纖維素酶活力最高，故下面選擇菌株giF-10進行鑒定。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 菌株菌落形態(tài)鑒定

菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，生長很快，菌落質(zhì)地疏松，初白色、黃色，后變?yōu)榈G褐色，出現(xiàn)輪狀的菌絲密實產(chǎn)孢區(qū)，見圖1A。背面褐色。分生孢梗分枝較少，末端放射狀，頂囊近球狀，產(chǎn)生綠色孢子，孢子呈卵圓形。分生孢子壁光滑，菌絲體透明，如圖1B。

圖 1 菌株giF-10的培養(yǎng)性狀和形態(tài)Fig.1 Morphology and cultural characteristics of strain giF-10

2.2.2 分子生物學鑒定

PCR擴增得到長度為594bp的ITS序列，在NCBI上進行BLAST比對，giF-10 Aspergillus oryzae strain UPM A22同源性達99%，參考在GenBank的比對結(jié)果，利用MEGA4.0軟件以Neighbor-Joining計算方式生成系統(tǒng)發(fā)育進化樹，如圖2所示，結(jié)合形態(tài)學觀察結(jié)果與ITS分析結(jié)果，將真菌giF-10初步鑒定為米曲霉(Aspergillus oryzae)。

圖 2 菌株giF-10的ITS系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of stain giF-10 and corresponding strains based on ITS sequence

2.3 酶的分離純化

由圖3可知，粗酶液經(jīng)硫酸銨沉淀、Sephadex G-100凝膠層析、DEAE Cellulose 52離子交換層析得到了純的β-葡萄糖苷酶，分子質(zhì)量大約為90kD。從表1可以看出，活力損失較大的是在硫酸銨沉淀這一步，可能是因為在硫酸銨沉淀過程中局部鹽飽和度過高造成酶蛋白失活，或者在蒸餾水中脫鹽時間過長的緣故。β-葡萄糖苷酶最終純化倍數(shù)為11.31。

圖 3 純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of purified products

表 1 菌株giF-10產(chǎn)β-葡萄糖苷酶純化結(jié)果Table 1 Purification of β-glucosidase from strain giF-10

2.4 酶學性質(zhì)

2.4.1 酶的最適溫度

圖 4 β-葡萄糖苷酶的最適溫度Fig.4 Optimal reaction temperature of β-glucosidase

由圖4可知，β-葡萄糖苷酶的最適溫度約為55℃。溫度低于55℃時，酶活力隨溫度的升高而增大；溫度高于60℃時，酶活力隨溫度的升高而降低。溫度高于80℃時酶已近全部失活。

2.4.2 酶的熱穩(wěn)定性

由圖5可知，β-葡萄糖苷酶在30～50℃穩(wěn)定性最好，溫度超過50℃，酶活力急劇下降，60℃時酶活僅為最高酶活力的9%。

圖 5 β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性Fig.5 Thermal stability of β-glucosidase

2.4.3 酶的最適pH值

圖 6 β-葡萄糖苷酶的最適pH值Fig.6 Optimal pH of β-glucosidase

由圖6可知，β-葡萄糖苷酶的最適pH值為4.5。在pH4.0～6.0范圍內(nèi)，酶活性較好；當pH值低于4.0時，酶活力迅速降低；pH3.0環(huán)境下，β-葡萄糖苷酶活力僅為最適pH值條件下的17.8%；pH值高于6.0時，酶活力隨pH值的升高而降低；當pH值升至8.0時，酶活力降為最高酶活力的34.1%。

2.4.4 酶的pH值穩(wěn)定性

圖 7 β-葡萄糖苷酶的pH值穩(wěn)定性Fig.7 pH stability of β-glucosidase

由圖7可知，β-葡萄糖苷酶的pH值穩(wěn)定性較好，在pH4.0～6.0范圍內(nèi)酶活力可達最高酶活的90%以上。當pH值低于4.0時，酶的穩(wěn)定性隨著pH值的降低而降低，在pH3.0的緩沖液中處理1h，酶活力還有最高酶活力的49.5%；當pH值高于6.0時，酶穩(wěn)定性隨著pH值的升高而降低，在pH8.0的緩沖液中處理1h，酶活力僅為最高酶活力的15.2%。

2.4.5 金屬離子對β-葡萄糖苷酶活力的影響

緩沖體系中加入1mmol/L的離子后，對β-葡萄糖苷酶酶活性產(chǎn)了一定影響。由表2可知，Mn2+對β-葡萄糖苷酶活力有很強的激活作用，加入Mn2+后，β-葡萄糖苷酶活力為對照的238%。Fe2+、Ag+、Zn2+、Co2+對酶活力也有一定的激活作用。而Fe3+、Cu2+對β-葡萄糖苷酶活力有較強的抑制作用，使得酶活力僅為對照的6%、39%。K+對β-葡萄糖苷酶也有一定的抑制作用。Ca2+、Mg2+、Ba2+、Li+、Co2+、Na+對酶活力影響不明顯。

表 2 金屬離子對β-葡萄糖苷酶活力影響Table 2 Effect of metal ion on β-glucosidase activity

2.4.6 酶的底物特異性

圖 8 β-葡萄糖苷酶的底物特異性Fig.8 Substrate specificity of β-glucosidase

由圖8可知，β-葡萄糖苷酶對不同纖維素底物具有不同的分解能力。它不能分解羧甲基纖維素和微晶纖維素。但對纖維二糖和水楊素的特異性很高。

2.4.7 動力學參數(shù)

圖 9 β-葡萄糖苷酶的雙倒數(shù)圖Fig.9 Lineweaver-Burk plot of β-glucosidase

由圖9可知，利用雙倒數(shù)作圖法，分別測得該β-葡萄糖苷酶對水楊素的動力學參數(shù)：Km為0.676mmol/L，Vmax為0.0206μmol/(L·min)；對纖維二糖的動力學參數(shù)為：Km為2.906mmol/L，Vmax為0.138μmol/(L·min)。

3 結(jié)論與討論

本研究采用以CMC-Na為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基富集，并利用剛果紅平板染色法進行高效纖維素降解細菌的初篩，可以根據(jù)菌落周圍透明暈圈迅速捕獲目的菌株。β-葡萄糖苷酶的酶活力確證篩選菌株，獲得了1株高效纖維素降解菌giF-10，其酶活力為2.522U/mL。該酶酶活力高于一般報道[14]，具有研究價值。

菌株giF-10的形態(tài)特征與曲霉相似，通過ITS序列分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹可確定菌株giF-10為米曲霉(Aspergillus oryzae)。目前國內(nèi)以米曲霉為纖維素酶的產(chǎn)生菌的報道較少。米曲霉是美國食品與藥物管理局和美國飼料公司協(xié)會在1989年公布的40余種安全微生物菌種之一[15]，由于高安全性，其產(chǎn)物酶的應(yīng)用范圍將非常廣范，尤其在食品領(lǐng)域?qū)⒕邆漭^大應(yīng)用前景。目前，對該酶的研究多以木霉(Trichoderma)為主，但木霉產(chǎn)酶慢，酶系比活力不高，普遍存在β-葡萄糖苷酶酶活力很低的缺陷[16]。有研究者[17]在木霉纖維素酶中添加曲霉的β-葡萄糖苷酶，極大地提高了纖維素酶的降解能力。并且，曲霉中β-葡萄糖苷酶具有更高的活性和穩(wěn)定性。

本研究表明，純化后的β-葡萄糖苷酶最終純化倍數(shù)為11.31，純化酶的比活力為40.84U/mg。相比黑曲霉中β-葡萄糖苷酶的最終純化倍數(shù)8.42，酶的比活力65.06U/mg[18]，本研究的純化倍數(shù)較高，但酶活力較低，可能是在硫酸銨沉淀過程中β-葡萄糖苷酶損失較多。經(jīng)SDS-PAGE分析，β-葡萄糖苷酶分子質(zhì)量約為90kD，菌株A.oryzae sp.100的β-葡萄糖苷酶分子質(zhì)量為77kD[19]，分子質(zhì)量的不同可能是表達調(diào)控的不同造成的。該酶最適pH值為4.5，在pH4.0～6.0穩(wěn)定性較好，活力均可達最高酶活的90%以上。說明β-葡萄糖苷酶在酸性條件下活性高且較為穩(wěn)定，因此該酶適合在酸性介質(zhì)中應(yīng)用，如添加在果汁、果酒等果制品中作為風味劑。但其熱穩(wěn)定性較差，需進一步運用基因工程手段對其進行改造，以獲得熱穩(wěn)定性提高的工程菌。

酶是一種蛋白質(zhì)，它的催化效果受諸多因素影響。本研究中Mn2+、Fe2+、Ag+、Zn2+、Co2+對β-葡萄糖苷酶有不同程度的激活作用，特別是Mn2+可以使酶活提高1.38倍，這些激活劑可能是作為酶的輔酶存在，或者形成共價物，使底物更加易參加反應(yīng)；Fe3+、Cu2+對β-葡萄糖苷酶活力有抑制作用，可能是這些金屬離子引起了酶構(gòu)象的改變，使酶喪失了部分生物活性。根據(jù)文獻[20]報道來源于曲霉N0.5.1的β-葡萄糖苷酶，K+、Na+、Mg2+和Zn2+對其有激活作用，而Ag+和Fe2+對其具有明顯的抑制作用。來自黑曲霉(Aspergillus sp. NL-1)的β-葡萄糖苷酶，Ag+對該酶具有強的抑制作用，其他金屬離子對酶的活性影響不大[21]。不同金屬離子對酶活力的影響不同，離子對酶活力的影響作用可應(yīng)用于酶制劑的加工和處理中，用以保持酶的穩(wěn)定性。

[1] Edwin Clifford Webb. Enzyme nomenclature： recommendations of the nomenclature committee of the international Union of biochemistry and molecular biology on the nomenclature and classification of enzymes[M]. San Diego： Academic Press, 1992： 310.

[2] 曾青蘭. 纖維素酶研究進展[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學, 2007(6)： 42-46.

[3] 鄔敏辰, 鄭建豐. 黑曲霉液體發(fā)酵纖維素酶的研究[J]. 釀酒科技, 1998(3)： 25-28.

[4] 宛曉春, 湯堅, 丁霄霖. 黑曲霉β-葡萄糖苷酶的提純與性質(zhì)[J]. 菌物系統(tǒng), 1998, 17(2)： 154-159.

[5] 陶寧萍. 苦杏仁酶在純天然青梅果汁中的應(yīng)用[D]. 南京： 南京農(nóng)業(yè)大學, 1993.

[6] 李平, 宛曉春, 丁霄霖, 等. 黑曲霉β-葡萄糖苷酶的食品增香應(yīng)用[J] . 食品與發(fā)酵工業(yè), 2000, 26(2)： 5-6; 32.

[7] 陳士華, 耿瑞凡, 雪珍, 等. 黑曲霉bgl基因在畢赤酵母中的研究表達[J]. 河南工業(yè)大學學報： 自然科學版, 2010, 31(5)： 42-45.

[8] 趙麗萍, 陳亮, 王新超, 等. 茶樹新梢不同葉片中β-葡萄糖苷酶和β-櫻草糖苷酶基因表達的實時定量PCR[J]. 茶葉科學, 2006, 26(1)： 11-16.

[9] MORA P, MIAMBI E, JIMENEZ J J, et al. Functional complement of biogenic structures produced by earthworms, termites and ants in the neotropical savannas[J]. Soil Biology & Biochemistry, 2005, 37： 1043-1048.

[10] 張?zhí)K龍, 呂淑霞, 林英, 等. 一株產(chǎn)纖維素酶真菌的篩選、鑒定及酶學性質(zhì)初步研究[J]. 微生物學雜志, 2009, 29(3)： 72-76.

[11] 朱鳳妹, 杜彬, 劉長江, 等. β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌搖瓶發(fā)酵條件的研究[J]. 食品科學, 2008, 29(8)： 422-424.

[12] WANG Fengchao, LI Fan, CHEN Guanjun, et al. Isolation and characterization of novel cellulase genes from uncultured microorganisms in different environmental niches[J]. Microbiological Research, 2009, 164(6)： 650-657.

[13] 孫立夫, 張艷華, 裴克全. 一種高效提取真菌總DNA的方法[J]. 菌物學報, 2009, 28(2)： 299-302.

[14] 趙林果, 周潭澈, 盂鵬. β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的篩選及其所產(chǎn)纖維素酶酶系組成分析[J]. 工業(yè)微生物, 2007, 37(5)： 47-50.

[15] 朱婧, 覃擁靈, 陳桂光, 等. β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株的選育及酶法轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)龍膽低聚糖[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2010, 36(4)： 21-25.

[16] WEN Zhiyou, LIAO Wei, CHEN Shulin. Production of celluloae/β-glucosidase by the mixed fungi culture and on dairy manure[J]. Precess Biochemistry, 2005, 40： 3087-3094.

[17] 潘利華, 羅建平. β-葡萄糖苷酶的研究及應(yīng)用進展[J]. 食品科學, 2006, 27(12)： 803-807.

[18] 鄭淑霞, 沈志揚, 劉樹滔, 等. 黑曲霉發(fā)酵粉中一種β-葡萄糖苷酶的分離純化與表征[J]. 福州大學學報： 自然科學版, 2004, 32(1)： 101-105.

[19] ZHANG Chunzhi, LI Dai, YU Hongshan, et al. Purification and characterization of piceid-β-D-glucosidase from Aspergillus oryzae[J]. Process Biochemistry, 2007, 42： 83-88.

[20] 謝宇, 尚曉嫻, 胡金剛. β-葡萄糖苷酶純化及酶學性質(zhì)研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學學報, 2008(3)： 521-524.

[21] 趙林果, 游麗金, 孟鵬, 等. 黑曲霉胞外耐高糖β-葡萄糖苷酶的分離純化及部分特性研究[J]. 林產(chǎn)化學與工業(yè), 2007, 27(6)： 41-47.