牛會(huì)敏，李苗云*，趙改名，張秋會(huì)，田 瑋，黃現(xiàn)青，柳艷霞，張建威，高曉平，孫靈霞

(河南省肉制品加工與質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

近年來，冷卻豬肉逐漸發(fā)展成為我國(guó)生鮮肉消費(fèi)的主流，國(guó)內(nèi)外關(guān)于冷卻豬肉中假單胞菌生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型已經(jīng)做了大量研究[1-4]。在預(yù)測(cè)微生物學(xué)領(lǐng)域，修正的Gompertz、Baranyi、Logistic及Huang等初級(jí)模型常被用來描述微生物數(shù)量隨時(shí)間的變化關(guān)系，在已有的研究中，大都選用單一的模型來描述假單胞菌數(shù)量隨時(shí)間變化的函數(shù)關(guān)系。盡管很多不同的非線性方程被當(dāng)做模型用來預(yù)測(cè)微生物的生長(zhǎng)，但并不能確定哪一種模型可以在本質(zhì)上更優(yōu)于其他模型[5]。在模型選擇上很多學(xué)者做出了相當(dāng)多得努力，一些比較研究文獻(xiàn)也有報(bào)道[6-9]，然而有必要直接采用以實(shí)際食品為培氧基質(zhì)而培養(yǎng)的微生物數(shù)據(jù)來評(píng)價(jià)常用初級(jí)模型的統(tǒng)計(jì)擬合能力。

本實(shí)驗(yàn)選擇3種常用的初級(jí)模型來擬合由冷卻豬肉復(fù)雜微生物體系中直接測(cè)定的假單胞菌生長(zhǎng)數(shù)據(jù)，用殘差值分布圖及殘差平方和(residual sum of squares，RSS)，殘差標(biāo)準(zhǔn)誤(residual standard error，RSE)及赤池信息量準(zhǔn)則(akaike information criterion，AIC)等統(tǒng)計(jì)指標(biāo)來綜合比較分析3種模型擬合托盤包裝冷卻豬肉中假單胞菌生長(zhǎng)的情況，為冷卻豬肉假單胞菌預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)體系模型選擇提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷卻豬肉豬背最長(zhǎng)肌 河南漯河雙匯集團(tuán)。

假單胞菌瓊脂(CM0559、SR0103E，PE真空包裝袋) 英國(guó)Oxoid公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HVE-50壓力蒸汽滅菌鍋 日本Hirayama公司；SPX-1505H-Ⅱ生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械公司；SW-CJ-2F潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；MIR-254 低溫恒溫培養(yǎng)箱 日本Sanyo公司；VORTEX-2 GENIE 渦旋振蕩器 美國(guó)Scientific Industries公司。

1.3 方法

1.3.1 取樣及貯藏

從雙匯集團(tuán)分割生產(chǎn)線隨即采取豬背最長(zhǎng)肌，用保鮮膜包裹，放置裝有冰袋的保溫箱中，迅速轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。修去筋腱后，將肉無菌切成小塊，按質(zhì)量稱取每袋220g左右進(jìn)行真空包裝，在0、5、10℃條件下貯藏。貯藏在0℃條件下的冷卻豬肉，每隔48h取樣測(cè)定假單胞菌；5℃貯藏的樣品每隔24h取樣測(cè)定；10℃貯藏的樣品每隔12h取樣測(cè)定。

1.3.2 冷卻豬肉中假單胞菌的計(jì)數(shù)方法

無菌操作稱取25g樣品，用剪刀剪碎后置于裝有225mL的8.5%滅菌生理鹽水的錐形瓶中，充分振搖，取100μL按1：10進(jìn)行倍比稀釋，之后按照修改的6×6點(diǎn)樣法[10]進(jìn)行微生物測(cè)定。每組樣品做5次平行。

1.3.3 微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型

在預(yù)測(cè)微生物學(xué)領(lǐng)域，預(yù)測(cè)模型是按數(shù)學(xué)模型進(jìn)行分類的，初級(jí)模型表征的就是在一定生長(zhǎng)環(huán)境和條件下微生物數(shù)量隨時(shí)間變化的關(guān)系。選擇3種常用的初級(jí)模型來擬合低溫條件下冷卻豬肉中假單胞菌的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)。

修正的Gompertz模型是經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ停畛醪皇窃O(shè)計(jì)用來描述微生物生長(zhǎng)，只是模型中的參數(shù)被賦予了物理含義來解釋微生物的生長(zhǎng)參數(shù)，而這些參數(shù)在建立和解釋模型時(shí)都發(fā)揮了重要作用，此模型因使用簡(jiǎn)單而被廣泛應(yīng)用于預(yù)測(cè)微生物的生長(zhǎng)。為了直接與另外兩個(gè)生物學(xué)基礎(chǔ)的模型進(jìn)行比較，本實(shí)驗(yàn)用自然對(duì)數(shù)值取代常用對(duì)數(shù)值，修正的Gompertz模型直接表述為：

式中：Y是t時(shí)微生物的自然對(duì)數(shù)值(ln(CFU/g))；Nmax和N0分別是Y的初始值、最大值；μG是在時(shí)間M時(shí)的相對(duì)最大生長(zhǎng)速率；M是達(dá)到相對(duì)最大生長(zhǎng)速率所需要的時(shí)間。恒溫條件下遲滯期λ和生長(zhǎng)速率K可根據(jù)公式(2)、(3)計(jì)算。

由Baranyi等[11]在1994年提出的Baranyi模型得到了越來越廣泛的應(yīng)用，其最大的優(yōu)點(diǎn)就是擬合性較高，并且使用方便；動(dòng)態(tài)環(huán)境也可以使用；適合多種情況；模型中的參數(shù)都具有生理學(xué)意義，是真正意義上的動(dòng)力學(xué)模型。其方程描述如下。

式中：N0和ymax分別是Y的初始值、最大值；K是生長(zhǎng)速率。

遲滯期的計(jì)算根據(jù)公式(5)，參數(shù)h0只是使曲線擬合更適宜的原始數(shù)據(jù)的一個(gè)中間轉(zhuǎn)換[12]。

最后選擇的是Huang模型[13]，該模型來源于恒溫條件下微生物生長(zhǎng)情況的3個(gè)階段(遲滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期)，公式可以描述為式(6)、(7)。

公式中參數(shù)的生物學(xué)意義同Baranyi模型。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel分別計(jì)算每個(gè)樣品假單胞菌數(shù)取對(duì)數(shù)值后的平均值[平均lg()][14]，每個(gè)樣品假單胞菌取平均值后的對(duì)數(shù)值(N)，假單胞菌平均值的估計(jì)值(lgA)。

式中：k為lg菌落數(shù)；s為標(biāo)準(zhǔn)差。

采用SAS的統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)假單胞菌的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸擬合。目前，并沒有一個(gè)單獨(dú)并簡(jiǎn)單的統(tǒng)計(jì)方法來評(píng)價(jià)非線性模型之間的異同及如何優(yōu)先選擇一個(gè)模型這個(gè)問題。一般情況下，主要選擇殘差分析和擬合度等統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)來評(píng)價(jià)不同非線性模型之間的比較，從而綜合評(píng)價(jià)模型的整體擬合能力[15]。本實(shí)驗(yàn)用殘差分析、RSS、RSE及AIC來整體評(píng)價(jià)3種模型的擬合能力。RSS和RSE值越小，模型擬合效果越好。采用Excel軟件對(duì)擬合的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行繪圖。

式中：n為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的總數(shù)；p為模型中參數(shù)的個(gè)數(shù)；RSS為殘差平方和；n為數(shù)據(jù)的總數(shù)；m為模型中參數(shù)的個(gè)數(shù)。AIC是衡量統(tǒng)計(jì)模型擬合優(yōu)良性的一種標(biāo)準(zhǔn)，在不同的溫度條件下對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，AIC值最小的模型是最準(zhǔn)確的[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫條件下冷卻豬肉中假單胞菌的生長(zhǎng)特點(diǎn)

假單胞菌屬是嗜冷菌，一直被認(rèn)為是在有氧條件下引起冷卻肉腐敗的主導(dǎo)作用菌[17-18]。由圖1可知，3組溫度下假單胞菌的初始菌值分別是11.81(ln(CFU/g))、8.65(ln(CFU/g))和9.25(ln(CFU/g))，從遲滯期的細(xì)節(jié)圖2可以明顯看出，托盤包裝冷卻豬肉中假單胞菌在低溫條件下(0、5、10℃)出現(xiàn)明顯的菌數(shù)下降趨勢(shì)，隨后呈現(xiàn)典型“S”形生長(zhǎng)?？赡苁菢悠方?jīng)歷了從企業(yè)到實(shí)驗(yàn)室的溫度波動(dòng)歷程后，低溫貯藏抑制了假單胞菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致假單胞菌數(shù)量的下降。另外，假單胞菌是冷卻豬肉屠宰過程中污染的微生物，在豬肉這種新環(huán)境適應(yīng)過程中，細(xì)胞由于不適應(yīng)新環(huán)境生長(zhǎng)導(dǎo)致了死亡速率大于生長(zhǎng)速率，從而出現(xiàn)了初始假單胞菌數(shù)量下降的趨勢(shì)[19]。

圖 1 0(a)、5(b)、10℃(c)條件下冷卻豬肉中假單胞菌觀測(cè)值及擬合曲線Fig.1 Growth fitting curves of Pseudomonas in chilled pork at 0(a), 5 ℃(b) and 10 ℃(c)

圖 2 0(a)、5(b)、10℃(c)條件下冷卻豬肉中假單胞菌遲滯期細(xì)節(jié)圖Fig.2 lg phase of Pseudomonas in chilled pork at 0(a), 5 ℃(b) and 10 ℃(c)

2.2 3種模型統(tǒng)計(jì)指標(biāo)的比較分析

2.2.1 殘差分布的分析

圖 3 0(a)、5(b)、10℃(c)條件下3種模型擬合的冷卻豬肉中假單胞菌數(shù)據(jù)的相對(duì)殘差值分布圖Fig.3 Distribution of relative residuals for three kinetics models for Pseudomonas growth in chilled pork at 0(a), 5 ℃(b) and 10 ℃(c)

由圖3可知，在0℃條件下，3種模型的殘差值均圍繞殘差等于零的直線上下隨即分布，這說明回歸曲線對(duì)原觀測(cè)值的擬合情況良好。而相對(duì)于修正的Gompertz和Huang模型來說，Baranyi模型擬合的殘差值分布更集中，在±0.3的范圍內(nèi)波動(dòng)，說明在0℃條件下，Baranyi模型能更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)冷卻豬肉中假單胞菌的生長(zhǎng)狀況。在5℃條件下，修正的Gompertz模型擬合的殘差值分布相對(duì)集中，在殘差值等于零的直線上下隨即分布，范圍波動(dòng)在±0.4以內(nèi)，說明在此溫度下，修正的Gompertz模型能更準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)冷卻豬肉中假單胞菌的生長(zhǎng)情況。同樣的分析在10℃條件下，Huang模型是預(yù)測(cè)假單胞菌生長(zhǎng)最準(zhǔn)確的選擇。

2.2.2 擬合度統(tǒng)計(jì)指標(biāo)的分析

表1反映的是低溫條件下3種模型擬合的統(tǒng)計(jì)指標(biāo)的比較分析?？梢钥闯?，在0℃條件下，Baranyi模型擬合的RSS、AIC和RSE值是最小的，5℃條件下修正的Gompertz模型擬合的RSS、AIC和RSE值是最小的，而10℃條件下，擬合出最小RSS、AIC和RSE值的卻是Huang模型，3種模型中的任何一個(gè)模型都不能同時(shí)對(duì)所有溫度下的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表現(xiàn)出最佳的擬合能力。Baty等[20]在5～42℃范圍內(nèi)的不同條件下，比較了修正的Gompertz、Baranyi和Lag-exponential模型對(duì)15個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)里關(guān)于混合大腸桿菌O157：H7菌株生長(zhǎng)數(shù)據(jù)的擬合情況，得出沒有一個(gè)模型可以對(duì)所有的數(shù)據(jù)表現(xiàn)出持續(xù)的最佳擬合能力。

表 1 3種模型擬合的各項(xiàng)統(tǒng)計(jì)指標(biāo)的比較分析Table 1 Comparative analysis of statistical parameters obtained from three growth models

目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的研究中大多是采用單一的某一個(gè)模型對(duì)微生物進(jìn)行預(yù)測(cè)，如楊紅菊[21]、何帆[22]等均選用修正的Gompertz函數(shù)對(duì)不同包裝方式冷卻豬肉中的假單胞菌建立了動(dòng)力學(xué)生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型；Sivila[23]、Radovan[24]等使用Baranyi模型分別建立了有氧條件下生鮮禽肉中假單胞菌的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型。Koutsoumanis等[25]結(jié)合溫度和pH值的影響使用Baranyi分別建立了豬肉和牛肉中假單胞菌的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型。

對(duì)于建立微生物預(yù)測(cè)模型的數(shù)據(jù)收集來說，用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)與實(shí)際肉品不同，肉湯培養(yǎng)基體系穩(wěn)定，不考慮原料組織對(duì)微生物的影響，大都采用確定的某一個(gè)模型進(jìn)行建模；而實(shí)際肉品中微生物生長(zhǎng)體系復(fù)雜，通過自然污染的原料肉直接測(cè)定的數(shù)據(jù)考慮了肉中復(fù)雜的微生物生長(zhǎng)環(huán)境，能更真實(shí)的反映微生物的生長(zhǎng)情況，因此有必要研究此環(huán)境下的微生物生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型。

目前肉中假單胞菌的生長(zhǎng)大都單獨(dú)采用單一的模型進(jìn)行預(yù)測(cè)，對(duì)于冷卻豬肉來說，不同溫度下哪種模型更適用于預(yù)測(cè)假單胞菌的生長(zhǎng)并不清楚。本實(shí)驗(yàn)直接以托盤包裝的冷卻豬肉作為研究對(duì)象，假單胞菌出現(xiàn)初始菌值下降趨勢(shì)的特點(diǎn)；選用不同的模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，找出了不同溫度下預(yù)測(cè)假單胞菌生長(zhǎng)的最適模型，Baranyi模型是0℃最適的，而5℃和10℃條件下的最適模型分別是修正的Gompertz和Huang模型。因此，通過以上分析和討論可知，對(duì)于復(fù)雜的肉品體系而言，不同的溫度條件下應(yīng)該選擇最適合的模型而不是單一的模型來預(yù)測(cè)假單胞菌的生長(zhǎng)，這也為冷卻豬肉實(shí)際生產(chǎn)中建立假單胞菌的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)體系提供了理論依據(jù)。

3 結(jié) 論

低溫條件下，托盤包裝冷卻豬肉中假單胞菌數(shù)量在遲滯期出現(xiàn)初始菌值下降的趨勢(shì)。在0、5、10℃條件下擬合冷卻豬肉中假單胞菌生長(zhǎng)的最適模型分別是Baranyi、修正的Gompertz和Huang模型。在對(duì)冷卻豬肉中假單胞菌進(jìn)行預(yù)測(cè)時(shí)，不同的溫度條件下應(yīng)該選擇最適合的模型而不是單一的模型來預(yù)測(cè)假單胞菌的生長(zhǎng)。

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