王 珍，李秀霞，李 嬌，勵(lì)建榮

(渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧省高校重大科技平臺(tái)“食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心”，遼寧錦州121013)

山楂(Crataegus pinnatifida Bge.)為藥食同源性藥材，根據(jù)藥效學(xué)研究，具有擴(kuò)冠、強(qiáng)心、降壓、降脂作用，臨床廣泛用于治療冠心病(如舒血寧)及高脂血癥［1］。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)黃酮物質(zhì)的檢測(cè)方法進(jìn)行了很多研究，彭全才等［2-3］研究利用反相高效液相法同時(shí)檢測(cè)包括蘆丁、金絲桃苷和槲皮素在內(nèi)多種物質(zhì)含量的檢測(cè)方法，分離效果好，但是耗時(shí)在一個(gè)小時(shí)之內(nèi);張永超等［4］用高效液相檢測(cè)山楂中各種黃酮的含量，單標(biāo)分別檢測(cè);王光忠［5-6］等在30min內(nèi)同時(shí)檢測(cè)出蘆丁和金絲桃苷的含量。據(jù)國(guó)內(nèi)外研究成果表明［7-9］，山楂果實(shí)中含量最多的黃酮屬槲皮素類，包括蘆丁、金絲桃苷和槲皮素。鑒于此，筆者研究一種耗時(shí)短、重復(fù)性好、適合槲皮素類黃酮含量的快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)藥品生物制品檢定所;槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)藥品生物制品檢定所;金絲桃甙標(biāo)準(zhǔn)品 寶雞市辰光生物科技有限公司;高效液相色譜檢測(cè)所用試劑均為色譜純，水為超純水。

高效液相色譜儀P680 美國(guó)戴安公司;電子天平FA2004 上海恒平科學(xué)儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-2000上海亞榮生化儀器廠;超純水機(jī)PS02-AD-DI 上海訊輝環(huán)保科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 待測(cè)樣品的提取 原料的處理 山楂→去核→50℃烘干→磨粉→過(guò)篩→成品→密封包裝

黃酮的提取方法:稱取山楂粉5g，用濾紙包好，放入索氏提取器，100mL 70% 乙醇［10］，回流提取5～8h，直至回流液無(wú)色為止。70℃減壓旋蒸濃縮，用甲醇定容于25mL 容量瓶中，待測(cè)。

1.2.2 高效液相色譜條件 色譜柱Develosil C30;流動(dòng)相:A 相為乙腈，B 相為0.4%磷酸水溶液，梯度洗脫。B 相隨時(shí)間變化:80% ～60.5% (0 ～26min)，60.5%～80% (26 ～26.1min)，80% (26 ～30min)流速1mL/min;柱溫40℃，進(jìn)樣20μL;檢測(cè)波長(zhǎng):360nm。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與曲線繪制 稱取適量各標(biāo)準(zhǔn)品，置于10mL 的容量瓶中，分別加入色譜級(jí)甲醇，超聲波助溶并定容至刻度，分別配成以下6 個(gè)濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(見(jiàn)表1)，封口保存?zhèn)溆谩０凑丈鲜錾V條件進(jìn)行HPLC 測(cè)定，做峰面積對(duì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線回歸方程。

1.2.4 樣品分析 在相同的液相色譜條件下，分別將標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液注入液相色譜儀中，以保留時(shí)間定性，以試樣峰面積與標(biāo)準(zhǔn)比較定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

稱取山楂粉5g，用濾紙包好，放入索氏提取器，加入100mL 70%乙醇，回流5～8h，直至回流液無(wú)色為止。70℃減壓旋蒸濃縮，用甲醇定容于25mL 容量瓶中，0.45μm 膜過(guò)濾，待測(cè)。

2.2 色譜條件的選擇

本研究發(fā)現(xiàn)蘆丁、金絲桃苷和槲皮素在360nm處有最大吸收波長(zhǎng)，且雜質(zhì)峰值小，流動(dòng)相為乙腈和0.4%磷酸水溶液，流速為1mL/min;柱溫40℃，進(jìn)樣20μL;檢測(cè)波長(zhǎng):360nm。山楂黃酮標(biāo)準(zhǔn)品色譜分離圖見(jiàn)圖1，山楂黃酮樣品色譜分離圖見(jiàn)圖2。圖1 中蘆丁、金絲桃苷和槲皮素三種物質(zhì)的光譜掃描圖像于圖的右側(cè)表示出，標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收波長(zhǎng)能夠大致確定該標(biāo)準(zhǔn)品，圖2 樣品圖中，三種目標(biāo)峰的出峰時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間有所出入，但是借助光譜掃描圖譜能夠確定樣品中的三種峰確實(shí)是三種被測(cè)物質(zhì)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在規(guī)定的色譜條件下，將標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣20μL進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明蘆丁在0.0005 ～0.16mg(R2=0.9999)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y =538.31x-0.3226;金絲桃苷在0.0016～0.05mg(R2=0.9996)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y =828.86x。槲皮素在0.0005 ～0.015mg(R2=0.9997)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y = 550.85x+0.044。

圖1 黃酮標(biāo)準(zhǔn)品色譜分離圖Fig.1 Standard chromatographic separation of figure of flavonoids from hawthorn

表1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各標(biāo)準(zhǔn)品的濃度表Table 1 The table of the concentration of standard substance in the mixed standard solution

2.4 方法學(xué)考察

圖2 山楂黃酮樣品色譜分離圖Fig.2 Sample chromatographic separation of figure of flavonoids from hawthorn

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6 次，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，蘆丁、金絲桃苷、槲皮素的峰面積的RSD 分別為0.78%、0.48%、0.69%，表明該檢測(cè)方法精密度良好。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4.2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品按供試品溶液的制備方法平行制備5 份，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，蘆丁的平均含量為1.886mg/g，金絲桃苷的平均含量為 1.148mg/g，槲皮素的平均含量為0.664mg/g。RSD 分別為1.1%、1.4%、1.6%，表明該方法重復(fù)性良好。

表2 精密度測(cè)定結(jié)果Table 2 Result of accuracy experiment

2.4.3 回收率實(shí)驗(yàn) 稱取已知各黃酮成分含量的山楂樣品5g，準(zhǔn)確加入蘆丁、金絲桃苷和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品，按照2.1 樣品液制備方法制備供試液。此測(cè)試液中黃酮成分的理論含量分別為:蘆丁1.886mg/g、金絲桃苷1.148mg/g、槲皮素0.664mg/g，重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算樣品的加樣回收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

2.5 樣品含量的測(cè)定

對(duì)樣品提取液檢測(cè)結(jié)果表明，山楂中蘆丁的含量為1.886mg/g，金絲桃苷的含量為1.148mg/g，槲皮素的含量為0.664mg/g。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)?zāi)康慕⒏咝б合嗌V法測(cè)定山楂總黃酮提取物中蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的含量的方法。方法采用HPLC 法，色譜柱DevelosilC30;流動(dòng)相:A相為乙腈，B 相為0.4%磷酸水溶液，梯度洗脫。B 相隨時(shí)間變化:80%～60.5%(0 ～26min)，60.5%～80%(26～26.1min)，80%(26.1～30min)流速1mL/min;柱溫40℃，進(jìn)樣20μL;檢測(cè)波長(zhǎng):360nm。結(jié)果蘆丁在0.005～0.16mg(R2=0.9999)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y =538.31x-0.3226，平均回收率為98.65%(RSD =0.383%);金絲桃苷在0.0016～0.05mg(R2=0.9996)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y =828.86x，平均回收率為94.15%(RSD =0.685%)。槲皮素在0.0005～0.015mg(R2=0.9997)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y =550.85x +0.0443，平均回收率為92.36%(RSD =0.306%)。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)山楂黃酮的分析方法進(jìn)行了改進(jìn)，三種黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰得到了很好的分離且出峰時(shí)間短，三種黃酮均為槲皮素類黃酮，這為今后其它槲皮素類黃酮物質(zhì)的高效液相檢測(cè)提供理論依據(jù)。

表3 重現(xiàn)性測(cè)定結(jié)果Table 3 Result of reproducibility experiment

表4 山楂黃酮回收率測(cè)定結(jié)果Table 4 Result of the recovery experiment of hawthorn flavone

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