鐘江燕，林敏慧，鄧尚貴

(浙江海洋學(xué)院食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山316000)

目前使用較多的防腐劑基本上是防腐效果明顯、來源廣泛、價(jià)格低廉的苯甲酸(鈉)和山梨酸(鉀)，但隨著其廣泛應(yīng)用，這些化學(xué)防腐劑的毒副作用也日漸突出［1］。目前，對(duì)于生物防腐劑(如乳酸鏈球菌素(Nisin)、曲酸、那他霉素等)的研究與應(yīng)用在國內(nèi)外已經(jīng)成為開拓食品防腐劑領(lǐng)域的熱點(diǎn)。生物防腐劑盡管具有抗菌性強(qiáng)、安全無毒、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用較為成熟的生物防腐劑普遍帶有一點(diǎn)色澤(如Nisin 呈現(xiàn)淡黃色)、抑菌譜窄、生產(chǎn)成本高等缺陷，使得單一生物防腐劑的抑菌效果總是不盡人意［2］。目前，許多研究都表明富馬酸一鈉和聚賴氨酸屬于高安全性類防腐劑［3-6］。富馬酸一鈉為結(jié)晶狀透明顆粒，在日本和韓國，其研究已經(jīng)很成熟，且已經(jīng)開發(fā)了以其作為主要成分的水產(chǎn)品復(fù)合型天然防腐劑。從性質(zhì)上來說，富馬酸一鈉兼有防腐、螯合金屬離子、抗氧化和緩沖pH 等多種功能，因此被廣泛用于復(fù)配型防腐劑的基礎(chǔ)配料［1］。聚賴氨酸為淡黃色粉末，不受pH 的影響，耐熱性好［7-8］。它對(duì)革蘭氏陰性、陽性菌都有很好的抑制效果，與富馬酸一鈉復(fù)合可以擴(kuò)大復(fù)配防腐劑的抑菌譜［9］。聚賴氨酸以ε-多聚賴氨酸(ε-PL)研究抑菌性為佳，其分子式如圖1:ε-PL 在人體內(nèi)分解為賴氨酸，是人體所需的八大氨基酸之一，也是世界各國允許在食品中強(qiáng)化的氨基酸，因此ε-PL 是一種營養(yǎng)型抑菌劑，安全性高于其他化學(xué)防腐劑［2］。

圖1 ε-PL 結(jié)構(gòu)圖Fig.1 ε-PL structure diagram

本文擬將富馬酸一鈉、聚賴氨酸進(jìn)行復(fù)配，以期探討鮮魚肉等水產(chǎn)食品中防腐劑使用問題，保障鮮魚肉等水產(chǎn)食品安全和人民身體健康。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮活鯽魚 2012 年4 月10 日購自浙江海洋學(xué)院食品與藥學(xué)學(xué)院附近的農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、沙門氏菌(salmonella)、副溶血性弧菌(Bibrio Parahemolyticus)、普通變形桿菌(Proteus vulgaris)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、熒光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens)、巨大芽孢桿菌(Bacillus magaterium)、八疊球菌(Sarcina)、藤黃八疊球菌(Sarcina lutea) 浙江省海洋學(xué)院食品與藥學(xué)學(xué)院511 實(shí)驗(yàn)室;黑根霉(Rhizopus nigricans Ehrenberg)、黃曲霉 (Aspergillus flavus Link )、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C.Hansen) 購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院;富馬酸一鈉 食品級(jí)，由鄭州億之源化工產(chǎn)品有限公司生產(chǎn);ε-聚賴氨酸(分子量為3000～4700g/mol)食品級(jí)，由南京賽泰斯生物科技有限公司生產(chǎn);革蘭氏染液。

玻璃培養(yǎng)皿90mm 北京華興科諾;YXQ-LS-30SII 高壓滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;HS-1300-U 超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;HWS-270 恒溫恒濕培養(yǎng)箱 寧波東南儀器有限公司;DHG-9140A 干燥烘箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;U- 2800 紫外可見分光光度計(jì)

HITACHI HIGH- TECHNOLOGIES CORPORATION;FJ300-SH 均質(zhì)器 上海標(biāo)本模型廠制造;HG63 水分測(cè)定儀梅特勒 上海右一儀器有限公司;PEN3 便攜式電子鼻 北京盈盛恒泰科技有限責(zé)任公司;N-180M 顯微鏡 上海麗馳計(jì)量儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 富馬酸一鈉和聚賴氨酸最佳抑菌濃度的確定 用滅菌水在超凈臺(tái)中準(zhǔn)確配制濃度梯度為200、300、400、500、600、700、800mg/L(為精確實(shí)驗(yàn)，后在抑菌圈最大的梯度附近找4～5 個(gè)點(diǎn)再進(jìn)行實(shí)驗(yàn))的富馬酸一鈉溶液和濃度梯度為200、250、300、350、400、450、500mg/L 的聚賴氨酸溶液［10］。先將配制好的108cfu/g 的大腸桿菌菌液用滅菌的干凈棉簽均勻地涂布在已經(jīng)凝固的營養(yǎng)培養(yǎng)基表面，在每個(gè)培養(yǎng)皿上放三個(gè)牛津杯(一個(gè)做空白對(duì)照)。每個(gè)牛津杯中注入200μL 富馬酸一鈉溶液或聚賴氨酸溶液，對(duì)照組加入200μL 無菌水，另外每個(gè)濃度各再做兩個(gè)平行。對(duì)每個(gè)培養(yǎng)皿做好記號(hào)，放在37℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 后取出測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.2 富馬酸一鈉和聚賴氨酸最佳配比的確定

1.2.2.1 初級(jí)配比形成 根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)找出的富馬酸一鈉和聚賴氨酸單獨(dú)最佳抑菌濃度，將兩者配制成成分比為富馬酸一鈉∶聚賴氨酸=1∶1、10∶1、5∶1、1∶5、1∶10 的五組溶液，每個(gè)配比做兩個(gè)平行，用1.2.1抑菌圈實(shí)驗(yàn)找出初步最佳配比。

1.2.2.2 最終配比形成 在以上五組配比中找出的最佳配比的左右再均勻的各取三個(gè)配比，每個(gè)配比做兩個(gè)平行，進(jìn)一步找出更精確的復(fù)配比例。

1.2.3 復(fù)合型防腐劑DSG01 的抑菌譜研究 將最佳抑菌濃度下的富馬酸一鈉和聚賴氨酸以及復(fù)合后的防腐劑DSG01 三者分別用于材料中的15 種菌中，測(cè)定各自的抑菌圈直徑，進(jìn)行比較，各自做兩個(gè)平行。

1.2.4 復(fù)合生物防腐劑的防腐實(shí)驗(yàn)——運(yùn)用在鮮魚中 將剛買來的新鮮鯽魚去頭去尾剖好，將魚肉平均分成34 份都為5cm ×3cm ×1cm 長方體形狀的鮮魚塊，每份50g 左右。分成兩組，每組各17 份，一組用已滅菌的軟刷均勻地涂抹30mL 配好的富馬酸一鈉和聚賴氨酸復(fù)合型生物防腐劑DSG01，另一組涂抹等量的無菌水。于相同的室溫環(huán)境下放置，測(cè)定鮮魚置于室溫條件下每天的以下各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.4.1 DSG01 對(duì)鮮魚菌落總數(shù)的影響 各兩份魚肉，每份25g，各加入225mL 無菌生理鹽水，8000 ～10000r/min 均質(zhì)器均質(zhì)1～2min，各配成稀釋濃度為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的菌液，吸取1mL 菌液到滅菌培養(yǎng)皿中，倒入15mL 左右的培養(yǎng)基，混勻。每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行，同時(shí)，分別吸取1mL 空白稀釋液加入兩個(gè)無菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。置于37℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 ± 2h，選取菌落數(shù)在30 ～300CFU 之間、無蔓延菌落生長的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU 的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300CFU 的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用三個(gè)平板的平均數(shù)。

1.2.4.2 DSG01 對(duì)鮮魚的水分含量的影響 各取兩組的魚肉(3 ±0.5)g 左右，用水分測(cè)定儀測(cè)定兩者的水分含量，每組做兩個(gè)平行，待儀器顯示“END”時(shí)讀取數(shù)據(jù)并記錄下來。

1.2.4.3 DSG01 對(duì)鮮魚的敏感氣味的影響 先將電子鼻儀器開啟預(yù)熱30min，各取兩組的魚肉(4 ±0.5)g 分別放入樣品采集瓶中，蓋上蓋子，使其氣味擴(kuò)散20min 以上(另外各做兩個(gè)平行組)。時(shí)間到后準(zhǔn)確測(cè)量，保存數(shù)據(jù)并統(tǒng)一處理。

1.2.4.4 DSG01 對(duì)鮮魚的感官品質(zhì)的影響 基本感官指標(biāo)與標(biāo)準(zhǔn)如下:a.聞氣味，是否有異味，以及刺鼻程度;b.看顏色，顏色是否發(fā)生變化;c.觸肉質(zhì)，肉質(zhì)是否變硬，水分是否有變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合型生物防腐劑DSG01 的形成

2.1.1 富馬酸一鈉和聚賴氨酸最佳抑菌濃度的確定

測(cè)量各個(gè)濃度下培養(yǎng)基中的抑菌圈直徑，每個(gè)濃度梯度下的三個(gè)平行取其平均值作為實(shí)驗(yàn)值，得富馬酸一鈉最佳抑菌濃度預(yù)確定結(jié)果。

觀察圖2，發(fā)現(xiàn)圖2 中抑菌圈的直徑都比較大，均超過14.5mm，可見富馬酸一鈉的抑菌性較好。抑菌圈直徑大小的走勢(shì)是先逐漸增大，到濃度為620mg/L 時(shí)抑菌圈直徑最大，此時(shí)其大小達(dá)到17.59mm，且當(dāng)濃度大于620mg/L 時(shí)，抑菌圈直徑不增反減。因此，可以確定富馬酸一鈉單獨(dú)使用時(shí)的最佳抑菌濃度為620mg/L。表3 是聚賴氨酸的抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果:

由圖3 的抑菌圈大小可以看出，聚賴氨酸的抑菌性較富馬酸一鈉弱，其抑菌圈直徑的大小在8～11mm之間，抑菌圈大小的變化也不是很大。根據(jù)圖形先增后減的趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)聚賴氨酸的濃度為400mg/L 時(shí)抑菌圈直徑最大，此時(shí)其大小為10.02mm。因此，可以得出聚賴氨酸單獨(dú)使用時(shí)的最佳抑菌濃度為400mg/L。

表1 復(fù)配型生物防腐劑的抑菌效果Table 1 Bacteriostatic ring sizes of the first time ratio

表2 第二次各配比比例下的抑菌圈大小Table 2 Bacteriostatic ring sizes of the second time ratio

圖2 富馬酸一鈉濃度梯度下抑菌圈大小Fig.2 Bacteriostatic ring sizes of the first concentration gradient

圖3 聚賴氨酸濃度梯度下的抑菌圈大小Fig.3 Bacteriostatic ring sizes of ploy-lysine concentration gradient

2.1.2 復(fù)配抑菌劑最佳配比的確定 以大腸桿菌為指示菌、抑菌圈直徑為指標(biāo)，采用牛津杯法確定最佳復(fù)配比例(表1、表2)。

由表1 和表2 可知，10∶1.4 是富馬酸一鈉和聚賴氨酸組成復(fù)合型生物防腐劑的最佳配比，并將富馬酸一鈉:聚賴氨酸為10∶1.4 的復(fù)配型生物防腐劑命名為DSG01。實(shí)驗(yàn)研究顯示(見圖1 和圖2)富馬酸一鈉在最佳抑菌濃度條件下抑菌圈直徑為17.59mm，聚賴氨酸在最佳抑菌濃度條件下的抑菌圈直徑為10.02mm(單獨(dú)使用抑菌效果不明顯)，而DSG01 的抑菌圈直徑達(dá)到19.81mm，表明DSG01 抑菌效果得到顯著提高。因此，DSG01 為濃度是620mg/L 的富馬酸一鈉與400mg/L 的聚賴氨酸以10∶1.4 比例配制而成。

2.1.3 復(fù)合型防腐劑DSG01 的抑菌譜研究 實(shí)驗(yàn)所得的15 種菌的抑菌譜數(shù)據(jù)如表3:

表3 抑菌譜實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 3 Antibacterial spectrum data

由表3 可見，此復(fù)合型防腐劑對(duì)革蘭氏陽性、革蘭氏陰性細(xì)菌均有很好的抑制效果，對(duì)耐熱性的枯草芽孢桿菌、嗜冷菌(如熒光假單胞桿菌)也有很好的抑菌性，并且復(fù)合后的防腐劑對(duì)于15 種細(xì)菌的抑菌圈直徑大多比單獨(dú)使用時(shí)要大;對(duì)霉菌和酵母菌的抑菌效果雖然相比細(xì)菌而言要差一些，但也有一定的抑菌效果，并且復(fù)合時(shí)比單獨(dú)使用的效果好。由此可見復(fù)合型防腐劑DSG01 的抑菌效果普遍比單獨(dú)使用時(shí)要強(qiáng)，抑菌譜變廣，具有很好的抑菌效果。另外，聚賴氨酸的抑菌性雖然沒有富馬酸一鈉好，但加入聚賴氨酸可以很好地?cái)U(kuò)大DSG01 的抑菌譜。

2.2 復(fù)合型生物防腐劑DSG01 對(duì)鮮魚品質(zhì)的影響

2.2.1 DSG01 對(duì)鮮魚菌落總數(shù)的影響 DSG01 對(duì)鮮魚菌落總數(shù)的影響如圖4 所示，由于實(shí)驗(yàn)材料是新鮮鯽魚肉，細(xì)菌本身生長迅速，此外，圖中做了對(duì)數(shù)函數(shù)，則使得兩者之間的差異更難以顯得非常明顯。但此復(fù)合型生物防腐劑DSG01 對(duì)鮮魚肉仍有較為明顯的抑菌效果，只是在第3d 正好相反，這是因?yàn)榧恿朔栏瘎┑孽r魚肉水分含量較高，而不加防腐劑鮮魚肉水分喪失很快，而水分含量對(duì)細(xì)菌的生長有一定作用。但是若在休閑水產(chǎn)品中，其水分含量本身很少，將影響不大。

圖4 DSG01 對(duì)鮮魚肉中菌落總落數(shù)的影響(20 ±1)℃Fig.4 Effect on total bacterial colonies in fresh fish adding DSG01(20 ±1)℃

2.2.2 DSG01 對(duì)鮮魚水分含量的影響 從圖5 可以發(fā)現(xiàn)，加入復(fù)合型生物防腐劑的鮮魚肉水分含量較高，也就是說其水分喪失比不添加的要小得多。因此，我們可以得出結(jié)論:富馬酸一鈉和聚賴氨酸組成的復(fù)合型生物防腐劑對(duì)水產(chǎn)品具有較好的持水效果。這將有效地保持休閑水產(chǎn)食品的營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

圖5 DSG01 對(duì)鮮魚肉水分含量的影響(20 ±1)℃Fig.5 Effect on water content in fresh fish adding DSG01(20 ±1)℃

2.2.3 DSG01 對(duì)鮮魚敏感氣味的影響 關(guān)于傳感器最敏感氣味的探究:將電子鼻數(shù)據(jù)經(jīng)過LO 圖分析［11-12］，得到圖6、圖7，發(fā)現(xiàn)電子鼻對(duì)于添加和未添加復(fù)合型防腐劑的鮮魚肉中最敏感的氣味都是含氮化合物(橫坐標(biāo)值最大的點(diǎn)所代表的為傳感器最敏感氣味)，但是不添加復(fù)合型防腐劑的新魚肉更加敏感(橫坐標(biāo)的main axis 值約為0.89)，而添加防腐劑的相對(duì)而言小些，約為0.78。因此氣味中氮氧化合物的指標(biāo)變化最能反映該復(fù)合型防腐劑的效果，當(dāng)然從兩表的比較也可見不添加此復(fù)合型防腐劑的魚肉含氮化合物的變化更明顯些，而添加了防腐劑的相對(duì)平緩些，這對(duì)于水產(chǎn)品的感官指標(biāo)的保持將起到重大作用。

圖6 不加防腐劑鮮魚肉電子鼻LO 分析圖Fig.6 Electronic noses LO analysis diagram of fresh fish without preservative

圖7 添加防腐劑鮮魚肉電子鼻LO 分析圖Fig.7 Electronic noses LO analysis diagram of fresh fish with preservative

2.2.3.1 DSG01 對(duì)鮮魚肉中氮氧化合物的影響 從圖8 可以看出添加DSG01 的鮮魚肉中的氮氧化合物成分要比不添加的對(duì)照組略低，兩者差異不是很大的主要原因是水分含量的變化，未添加DSG01 的魚肉水分失去比添加DSG01 的魚肉要快(圖5)，這將使得未添加DSG01 的魚肉在較干的情況下腐敗氣味的產(chǎn)生比之前緩慢一些，這也是第4d 添加DSG01 和未添加DSG01 的魚肉中氮氧化合物的G0/G 值相差不多的主要原因。氮氧化合物的多少是判定鮮魚品質(zhì)好壞的直接也是重要指標(biāo)，所以對(duì)水產(chǎn)食品中的氮氧化合物研究很重要［13-14］。同理，第4d 時(shí)由于水分含量的影響導(dǎo)致效果有些不明顯。

圖8 DSG01 對(duì)鮮魚肉中氮氧化合物的影響(20 ±1)℃Fig.8 Effect on nitrogen oxygen compounds in fresh fish adding DSG01(20 ±1)℃

2.2.3.2 DSG01 對(duì)鮮魚肉中芳香成分的影響 芳香成分的存在，有利于提高水產(chǎn)食品的感官特性，對(duì)于風(fēng)味的維持起到一定作用，同時(shí)也可以間接地作為評(píng)定水產(chǎn)食品品質(zhì)的一項(xiàng)指標(biāo)。從圖上看來，該復(fù)合型生物防腐劑DSG01 對(duì)于鮮魚肉中的芳香成分具有一定的維持作用，放置前期(第1d 至第3d)兩者的G0/G 值差不多大，但放置后期(第4d 開始)添加DSG01 的魚肉中芳香成分開始逐漸高于未添加DSG01 的魚肉。因此，DSG01 對(duì)于魚肉芳香成分的維持主要體現(xiàn)在放置后期，其效果比不添加DSG01的鮮魚肉要好。

圖9 DSG01 對(duì)鮮魚肉中芳香成分的影響(20 ±1)℃Fig.9 Effect on aromatic constituents in fresh fish adding DSG01(20 ±1)℃

2.2.3.3 其它的氣味成分 根據(jù)圖8～圖11 可以發(fā)現(xiàn):添加富馬酸一鈉和聚賴氨酸的復(fù)合型生物防腐劑DSG01 后，含氮化合物及硫化物兩種成分上差別較大;芳香成分的維持比不加的鮮魚肉要好;氫氣含量明顯高，可能與不加防腐劑的魚肉細(xì)菌呼吸更加旺盛有一定關(guān)系。

另外加入DSG01 的鮮魚肉中甲烷的數(shù)值比不加的要高，而烷烴成分的變化不是很明顯。

這些硫化物(芳香成分)、烷烴芳香成分對(duì)于魚肉的鮮味具有維持作用，對(duì)于魚肉的品質(zhì)也有輔助作用［15-16］。芳香成分存在的量是魚肉新鮮度的一個(gè)表征，實(shí)驗(yàn)顯示的結(jié)果表明:DSG01 具有減緩鮮魚肉產(chǎn)生腐敗氣味的作用和維持其魚體特有的芳香氣味的效果。

圖10 DSG01 對(duì)鮮魚肉中硫化物的影響(20 ±1)℃Fig.10 Effect on sulfide in fresh fish adding DSG01(20 ±1)℃

2.2.3.4 DSG01 對(duì)鮮魚感官品質(zhì)的影響 觀察兩組樣品在放置時(shí)間中每天的感官品質(zhì)的變化，如表4所示。

圖11 DSG01 對(duì)鮮魚肉中氫氣的影響(20 ±1)℃Fig.11 Effect on hydrogen in fresh fish adding DSG01(20 ±1)℃

感官品質(zhì)是影響食品品質(zhì)的重要因素，從表4可以明顯地比較出兩組樣品感官品質(zhì)變化的差異:添加了DSG01 的鮮魚肉腐敗氣味產(chǎn)生得較慢，油色出現(xiàn)得較晚，并且魚體僅是表皮變干，肉質(zhì)的持水性仍然較好;相比之下，未添加DSG01 的鮮魚肉在放置的第2d 就開始出現(xiàn)異味，而且馬上產(chǎn)生刺鼻的異味，肉質(zhì)也在第3d 明顯變干，隨后在第4d 就出現(xiàn)了金黃的油色。由實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象可以發(fā)現(xiàn)DSG01 具有維持食品感官品質(zhì)、減緩食品感官品質(zhì)變化的效果，而食品的感官品質(zhì)也是食品品質(zhì)質(zhì)量的一個(gè)重要組成部分。

表4 添加和未添加DSG01 的鮮魚感官品質(zhì)變化(20 ±1)℃Table 4 Fresh fish＇s perceptions quality changes of with and without DSG01(20 ±1)℃

3 結(jié)論

對(duì)于運(yùn)用在食品(特別是水產(chǎn)食品)中的生物防腐劑的研究仍然還需大量的工作和科學(xué)依據(jù)，但是也就是因?yàn)樯锓栏瘎┧赜械母鞣N優(yōu)勢(shì)，使得現(xiàn)階段所做的各項(xiàng)研究和工作對(duì)于其在食品中的應(yīng)用具有重大價(jià)值。富馬酸一鈉價(jià)格低廉，防腐效果明顯并且無色、安全;聚賴氨酸價(jià)格雖然略高，并帶有一定色澤，但是由于其在此復(fù)合型防腐劑中濃度只為400mg/L，并且與富馬酸一鈉的配比比例為1.4∶10，所呈現(xiàn)的顏色很淺，用量不多，兩者復(fù)合后抑菌譜變廣且防腐效果明顯，所以兩者的復(fù)配具有很好的研究和使用前景，DSG01 的存在也將對(duì)食品的保鮮具有重要價(jià)值。

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