楊秋慧子，孫亞莉，張喜峰，*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京210095;2.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅張掖734000)

“熊貓豆”是我國(guó)河西走廊的珍稀名貴彩色豆種。形狀、口感獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)豐富，易熟，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高［1］。蛋白質(zhì)含量高達(dá)34.5%。熊貓豆氨基酸種類齊全，人體中不能合成的8 種必需氨基酸中，除色氨酸和蛋氨酸含量稍低外，其余6 種含量均高，尤以賴氨酸含量豐富。目前我國(guó)對(duì)熊貓豆中蛋白質(zhì)的研究相對(duì)較少［2］。傳統(tǒng)提取蛋白質(zhì)常采用硫酸銨沉淀法、溶劑提取法、等電點(diǎn)沉淀法等存在樣品處理量小、回收率較低、操作繁瑣、周期較長(zhǎng)的缺點(diǎn)。雙水相萃取操作條件溫和、處理量大、易于連續(xù)操作、且蛋白質(zhì)能保持其天然的空間構(gòu)型，不易失活［3］。本實(shí)驗(yàn)以熊貓豆為實(shí)驗(yàn)材料，采用Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)、中心組合設(shè)計(jì)對(duì)雙水相萃取分離熊貓豆蛋白質(zhì)的條件進(jìn)行優(yōu)化。促進(jìn)熊貓豆蛋白功能食品加工可持續(xù)發(fā)展，以期為熊貓豆蛋白利用開(kāi)辟新的途徑，為其工業(yè)化提取熊貓豆蛋白質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

熊貓豆 購(gòu)于張掖市甘州區(qū)新樂(lè)超市;PEG(600、1000、2000、4000、6000)、硫酸銨、牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、磷酸、95%乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉 均為分析純。

粉碎機(jī) 河北黃驊新興電器廠;PL203 電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;XO-SM50超聲-微波反應(yīng)系統(tǒng) 南京先歐儀器制造有限公司;DKB-501 數(shù)顯超級(jí)恒溫水浴鍋 揚(yáng)州市三發(fā)電子有限公司;DHG-9101.1 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 揚(yáng)州市三發(fā)電子有限公司;722 型分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;CR-21 高速離心機(jī) 日本日立;漩渦混合器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 熊貓豆中蛋白質(zhì)的粗提取 稱取熊貓豆粉末5g，加入100mL pH7.0 的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，超聲- 微波提取5min，將得到的懸濁液于6000r/min 離心10min，傾倒上清液可得到含蛋白質(zhì)的粗提液，測(cè)定粗提液中蛋白質(zhì)含量。

1.2.2 考馬斯亮藍(lán)G-250 測(cè)定蛋白含量［4］5 支試管中，分別精確吸取120μg/mL 牛血清蛋白原液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL，用蒸餾水全部稀釋至1.0mL，然后分別加入5.00mL 考馬斯亮藍(lán)溶液，混合均勻，于(25 ±1)℃的恒溫水浴中保溫10min，冷水浴中冷卻后，立即于595nm 波長(zhǎng)處比色測(cè)定。以1.0mL蒸餾水代替樣品液，加入5.00mL 考馬斯亮藍(lán)溶液，其余操作同上，做空白對(duì)照。

1.2.3 雙水相系統(tǒng)相圖制作［5］精確稱取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的不同相對(duì)分子質(zhì)量的PEG 于試管中，加入1g ddH2O，用滴定管緩慢滴加已配好的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%(NH4)2SO4溶液，并在漩渦混合器上混合，觀察溶液的澄清程度，直至試管中溶液開(kāi)始出現(xiàn)渾濁為止。記錄(NH4)2SO4的加量(g)。然后加水，使其澄清，繼續(xù)向試管中滴加(NH4)2SO4溶液并不斷混勻，直至再次達(dá)到渾濁，如此反復(fù)操作。計(jì)算每次達(dá)到渾濁時(shí)，PEG 和(NH4)2SO4在系統(tǒng)總量中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(g/g)，以PEG 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)作圖，即得到一條雙節(jié)線。

1.2.4 雙水相萃取方法 固定體系總質(zhì)量為10.00g，加入適量的PEG、(NH4)2SO4、粗蛋白提取液，充分振蕩使成相物質(zhì)溶解，同時(shí)完成了熊貓豆蛋白在雙水相系統(tǒng)中的分配過(guò)程，在一定條件下萃取。此雙水相系統(tǒng)靜置一定時(shí)間，當(dāng)兩相達(dá)到相分離，熊貓豆蛋白質(zhì)富集于雙水相系統(tǒng)的上相中，讀取上下相體積，求相比R;分別測(cè)定上下相蛋白質(zhì)濃度，計(jì)算熊貓豆蛋白質(zhì)的分配系數(shù)K 及萃取率Y，如下式:

1.2.5 Plackett-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取可能影響雙水相萃取蛋白質(zhì)的7 個(gè)因素進(jìn)行Plackett- Burman 設(shè)計(jì)，每個(gè)因子取高(+1)和低(-1)2 個(gè)水平，響應(yīng)值為萃取率(Y)。實(shí)驗(yàn)因素、水平及編碼見(jiàn)表1。

表1 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平范圍Table 1 Factors and levels in the Plackett-Burman design

1.2.6 最陡爬坡實(shí)驗(yàn) 響應(yīng)面擬合方程只有在考察區(qū)域里才能充分近似真實(shí)情況，所以先逼近最大萃取率區(qū)域后才能建立有效的擬合方程。根據(jù)PB 實(shí)驗(yàn)篩選出顯著因子，進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，以期尋找到最大萃取率。

1.2.7 星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn) 為在最大響應(yīng)區(qū)研究影響蛋白質(zhì)萃取率的因素，根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)原理，進(jìn)行二因素三水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，各因素及其水平見(jiàn)表2。

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平及其編碼Table 2 Levels of variables used in the Central composite design

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)595nm 處吸光度，繪制蛋白總量-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，以試管中牛血清白蛋白的總量(mg)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度值(A)為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到其線性方程為y =5.606x +0.0265(R2=0.9942)。

2.2 雙水相體系相圖

在室溫條件下，對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量分別為600、1000、2000、4000、6000 的PEG/(NH4)2SO4相圖進(jìn)行繪制，結(jié)果見(jiàn)圖1 所示。

圖1 不同相對(duì)分子質(zhì)量PEG 與(NH4)2SO4 的雙水相相圖Fig.1 Phase diagrams of different molecular weight PEG/(NH4)2SO4 in aqueous two-phase system

在室溫條件下，測(cè)定不同分子量PEG/(NH4)2SO4雙水相體系相圖，結(jié)果見(jiàn)圖1?？紤]到萃取是在兩相條件下進(jìn)行的，因此選擇在雙節(jié)線上方的質(zhì)量分?jǐn)?shù)點(diǎn)作為單因素的參考條件。當(dāng)(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，隨著PEG 相對(duì)分子質(zhì)量的增大，形成雙水相體系所需PEG 的濃度降低。因?yàn)镻EG 相對(duì)分子質(zhì)量越大，其憎水程度越強(qiáng)，且加大與(NH4)2SO4分相的動(dòng)力，導(dǎo)致臨界分相濃度降低［6］。

2.3 PEG 相對(duì)分子量對(duì)雙水相萃取蛋白質(zhì)分配行為的影響

固定PEG 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，考察PEG 相對(duì)分子量對(duì)熊貓豆中蛋白質(zhì)萃取效應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 PEG 相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)熊貓豆中蛋白質(zhì)萃取率的影響Fig.2 Effect of PEG molecular weight on extraction yield of protein from Phaseolus coccineus L

隨著PEG 相對(duì)分子量的增大，相黏度增大，成相物質(zhì)分子的空間阻礙作用增加［7］。由圖2 可知，增大PEG 的相對(duì)分子質(zhì)量，熊貓豆中蛋白質(zhì)的分配系數(shù)和萃取率總體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，是因?yàn)镻EG 分子量減小時(shí)，它的疏水性顯著減弱，使熊貓豆蛋白在上相的表面張力減小，從而易于向上相分配［8］。綜合考慮5 種PEG 中，PEG600 的萃取效果最好，并且熊貓豆蛋白質(zhì)在PEG600-(NH4)2SO4體系中的分配系數(shù)最高，故選PEG600 為雙水相系統(tǒng)成相物質(zhì)。

2.4 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Plackett-Burman 設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果表3。

利用Design-Expert 7.16 軟件對(duì)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，各因素的影響效果見(jiàn)表4。由表4 可見(jiàn)，X3(pH)和X4(溫度)對(duì)萃取率的影響最為顯著，而且pH 和溫度的效應(yīng)值為正，而其它因素對(duì)蛋白質(zhì)萃取影響較小，故在下一步響應(yīng)面分析中只考察pH 和溫度的最優(yōu)水平。

表3 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Plackett-Burman experiment design and corresponding results

表4 PB 實(shí)驗(yàn)參數(shù)估計(jì)表Table 4 Coefficient estimates of variables in PB design

2.5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)(Steepest ascent design)確定因素水平

由表4 各因素影響值可看出，要提高熊貓豆蛋白質(zhì)萃取率，應(yīng)增大pH 并且提高溫度對(duì)提高萃取率有促進(jìn)作用。以X3(pH)和X4(溫度)兩個(gè)因素的正負(fù)效應(yīng)確定下一步實(shí)驗(yàn)的變化方向、步長(zhǎng)，具體取值和實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。隨著兩個(gè)重要因素的不同變化，蛋白萃取率的變化趨勢(shì)是先上升后下降，其中在3 號(hào)水平上達(dá)到最大值，所以判斷最優(yōu)萃取條件在3 號(hào)水平附近，故選此水平為中心點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

表5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Steepest ascent design and corresponding results

2.6 中心組合設(shè)計(jì)及結(jié)果

爬坡實(shí)驗(yàn)中的3 號(hào)實(shí)驗(yàn)條件作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平的中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。以二因素三水平進(jìn)行響應(yīng)面中心組合實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Central composite design and corresponding results

依據(jù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法，使用 Design -Expert.8.0.5.0 軟件得到編碼空間二元二次函數(shù)模型:Y =42.84-0.97A +0.12B +1.12AB-15.04A2-3.77B2，方差分析及F 檢驗(yàn)結(jié)果列于表7。

由表7 可知，本模型擬合程度明顯，其F 值為37.43，p ＜0.0001，說(shuō)明模型極顯著;同時(shí)模型中參數(shù)A2極顯著，B2顯著。同時(shí)對(duì)比兩個(gè)因素的F 值可以看出，pH 的影響較溫度更大。對(duì)其失擬檢驗(yàn)的p =0.4778 ＞0.05，不顯著，說(shuō)明模型中不需要引入更高次數(shù)的項(xiàng)。決定系數(shù)R2=0.9640，表明96.40%的變化可由此模型解釋。

2.7 顯著因素水平的優(yōu)化

利用Design-Expert 軟件根據(jù)回歸方程進(jìn)行響應(yīng)面分析，繪制響應(yīng)面圖，結(jié)果如圖3 所示，利用Design-Expert 軟件對(duì)蛋白質(zhì)萃取率的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型進(jìn)行求導(dǎo)，可獲得該模型極值點(diǎn)，對(duì)函數(shù)進(jìn)行分析，得到最優(yōu)的萃取條件為pH 為7.0、溫度為35℃、PEG600 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%、蛋白樣品溶液加入量4mL、萃取90min，熊貓豆蛋白質(zhì)萃取率達(dá)42.85%。為了驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，在最佳萃取條件下做實(shí)驗(yàn)，實(shí)際萃取率為43.69%，可見(jiàn)該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際萃取情況。

表7 回歸分析結(jié)果Table 7 Results of regression analysis

圖3 溫度與pH 交互作用對(duì)蛋白質(zhì)萃取率影響的響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface showing the effect pH value and temperature on protein extraction yield

3 結(jié)論

采用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)、響應(yīng)面法，確定雙水相體系組成為PEG600 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、pH 為7.0、萃取溫度35℃、萃取90min 時(shí)，熊貓豆蛋白質(zhì)萃取率可達(dá)43.69%。因此，利用響應(yīng)面分析方法對(duì)熊貓豆蛋白質(zhì)的萃取條件進(jìn)行優(yōu)化，可以獲得最優(yōu)的工藝參數(shù)，能有效的減少工藝操作的盲目性，從而為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

［1］張勇.河西走廊珍稀品種-熊貓豆［J］.專業(yè)戶，2000，8:40.

［2］孟延發(fā)，孟雪琴，杜毅峰，等.熊貓豆β-D-半乳糖苷酶的基本性質(zhì)研究［J］.蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，37(4):89-93.

［3］馬春宏，朱紅，王良，等.雙水相萃取技術(shù)的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.光譜實(shí)驗(yàn)室，2010，27(5):1906-1913.

［4］劉葉青.生物分離工程實(shí)驗(yàn)［M］.北京:高等教育出版，2007:81-82.

［5］周紅航，王維香.聚乙二醇/硫酸銨雙水相體系萃取豬胰蛋白酶［J］.化工進(jìn)展，2009，28(2):305-308.

［6］袁晶，宋達(dá)峰，胡煒力，等.響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌素的雙水相萃取條件［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2011，11(3):90-96.

［7］王巍杰，徐長(zhǎng)波.雙水相萃取藻藍(lán)蛋白的研究［J］.食品工程，2010，5:92-94.

［8］鄭楠，劉杰.雙水相萃取技術(shù)分離純化蛋白質(zhì)的研究［J］.化學(xué)與生物工程，2006，23(10):7-9.