曹偉偉，朱曉娜，李明靜，2，*

(1.河南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，河南開封475004;2.河南大學(xué)，河南省天然藥物與免疫工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南開封475004)

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，衰老、癌癥及炎癥等疾病與體內(nèi)脂質(zhì)過氧化和自由基有著直接的關(guān)系［1］。天然抗氧化劑有抑制體內(nèi)脂質(zhì)過氧化和清除自由基的作用，同時(shí)可促進(jìn)體內(nèi)抗氧化酶與內(nèi)源性抗氧化劑的合成［2］，因此得到普遍關(guān)注，將會大量應(yīng)用于食品及保健品的生產(chǎn)中［3］?；ㄉt衣中富含多酚類物質(zhì)，具有抗氧化、抗自由基等生物活性［4］。但在花生加工過程中，花生紅衣仍然作為一種經(jīng)濟(jì)效益較低的副產(chǎn)品，并沒有得到合理的開發(fā)利用［5］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道提取多酚類物質(zhì)的方法如加熱回流方法［6］具有耗時(shí)長，溶劑浪費(fèi)嚴(yán)重，多酚物質(zhì)容易分解等缺點(diǎn)。閃式提取技術(shù)具有溶劑用量小、提取時(shí)間短和操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，是一種高效、節(jié)能的新型提取技術(shù)［7］，特別適合熱敏性物質(zhì)的提取。閃式提取已廣泛應(yīng)用于植物中的有效成分的提取，并取得了良好的效果。酪氨酸酶是生物合成黑色素細(xì)胞的主要限速酶，抑制酪氨酸酶的活性，可改善皮膚色素細(xì)胞中酪氨酸酶的代謝，阻止色素沉著，達(dá)到美白效果［8］。目前發(fā)現(xiàn)市場上許多化妝品中抑制酪氨酸酶活性的化學(xué)合成物質(zhì)存在安全問題，天然植物提取物具有無毒、安全等特點(diǎn)，因此，天然植物類化妝品的開發(fā)研究越來越受到國內(nèi)外廣大消費(fèi)者的青睞。本文擬用閃式提取技術(shù)對花生紅衣多酚類物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對花生紅衣總多酚對酪氨酸酶活性的抑制作用及抗氧化活性進(jìn)行測定，旨在為花生紅衣的綜合開發(fā)利用提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海市化工學(xué)?；S;Folin-Ciocalteu 試劑［9］:稱取5.00g 鉬酸鈉(NaMoO4)和20.00g 鎢酸鈉(NaWO4)于250mL 圓底燒瓶中，加入150mL 蒸餾水，10mL 85%的磷酸和20.0mL 濃鹽酸，冷凝回流10h，冷卻后，取下冷凝管，加入30.00g硫酸鋰(Li2SO4)和15.0mL 雙氧水(H2O2)，加熱沸騰20min 至亮黃色，冷卻后用蒸餾水定容于500mL 棕色容量瓶，于4℃冰箱里保存?zhèn)溆?酪氨酸酶(965U/mg)、3，4-二羥基苯氨酸(L-DOPA) 購于上海寶曼生物科技有限公司;1，1-二苯基苦肼基自由基(DPPH 自由基) 日本化成工業(yè)株式會;無水乙醇、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、Li2SO4、NaMoO4、NaWO4等試劑 均為國產(chǎn)分析純;蒸餾水。

花生紅衣 花生采于河南開封近郊，40℃干燥2h，然后60℃干燥2h，手工去皮，備用。

LabTech UV - BlueStar 紫外/可見分光光度計(jì) 北京萊伯泰科儀器有限公司;JHBE-50S 閃式提取器 河南金鼐科技發(fā)展有限公司;Martin Christ Alphal-2 冷凍干燥機(jī) German;DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南省予華儀器有限公司;PHS-P1酸度計(jì) 上海大普儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用福林-酚比色法［10］:精確稱取沒食子酸對照品0.0100g，用蒸餾水溶解并定容于250mL 的容量瓶中，得濃度為40μg/mL 的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別取體積為0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20mL 的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液于10mL 比色管中，依次加入3.00mL 蒸餾水，1.50mL Folin - Ciocalteu 試劑，3.00mL 飽和Na2CO3溶液，定容，在30℃恒溫水浴鍋中保溫30min。冷卻至室溫后在760nm 處測定吸光度。以沒食子酸對照液濃度x(μg/mL)為橫坐標(biāo)，以吸光度Y 為縱坐標(biāo)，得回歸方程為Y =0.1803x +0.014，R =0.9990。

1.2.2 花生紅衣總多酚的提取及含量測定 稱取干燥的花生紅衣粉末2.0000g(n =3)，用40mL 濃度為80%的乙醇溶液超聲提取，功率400W，提取30min，提取6 次，至提取液無色，合并提取液，蒸至醇干，用蒸餾水定容于100mL 容量瓶，作為總多酚提取液備用。

花生紅衣總多酚的含量，即超聲提取所得總多酚的量與樣品質(zhì)量的比值:

花生紅衣總多酚的含量(%)= 所得總多酚的量/樣品的質(zhì)量×100

精確吸取總多酚提取液1.00mL，用蒸餾水稀釋至50mL 容量瓶中。取上述稀釋液，按1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法操作，在760nm 處測定吸光度并計(jì)算得花生紅衣中總多酚的含量為17.40%，17.74%，16.82%，平均值為17.32%(RSD =3.25%，n =3)。

1.2.3 總多酚提取率計(jì)算公式 花生紅衣總多酚的提取率，即閃式提取所得花生紅衣總多酚的量與所用樣品中總多酚量的比值:

總多酚提取率(%)= 閃式提取得到的總多酚量/所用樣品中總多酚量×100

1.2.4 閃式提取條件的選擇 分別考察乙醇濃度、料液比和提取電壓對花生紅衣中總多酚提取率的影響，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上考察總多酚提取率，然后采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化得最佳工藝條件。

1.2.4.1 乙醇濃度的選擇 準(zhǔn)確稱取9 份粉碎的花生紅衣樣品各2.0000g，固定提取時(shí)間2min，提取電壓90V，分別加入40mL 體積分?jǐn)?shù)分別為0%、20%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液進(jìn)行閃式提取，將提取液減壓抽濾定容于100mL 容量瓶中，取一定體積溶液按照1.2.2 步驟測定，按照

1.2.3 的公式計(jì)算總多酚提取率。

1.2.4.2 料液比的選擇 準(zhǔn)確稱取5 份粉碎的花生紅衣樣品各2.0000g，固定提取時(shí)間2min，提取電壓90V，分別加入20、30、40、50、60mL 80%的乙醇溶液進(jìn)行閃式提取，將提取液減壓抽濾定容于100mL 容量瓶中，取一定體積溶液按照1.2.2 步驟測定，按照

1.2.3 的公式計(jì)算總多酚提取率。

1.2.4.3 提取電壓的選擇 準(zhǔn)確稱取5 份粉碎的花生紅衣樣品各2.0000g，固定提取時(shí)間2min，分別加入40mL 80%的乙醇溶液，控制提取電壓分別為80、85、90、95、100V 進(jìn)行閃式提取，將提取液減壓抽濾定容于100mL 容量瓶中，取一定體積溶液按照1.2.2 步驟測定，按照1.2.3 的公式計(jì)算總多酚提取率。

1.2.4.4 提取次數(shù)的選擇 準(zhǔn)確稱取4 份粉碎的花生紅衣樣品各2.0000g，固定提取時(shí)間2min，提取電壓90V，分別加入40mL 80%的乙醇溶液進(jìn)行閃式提取，考察提取1、2、3、4 次總多酚提取率，將提取液減壓抽濾定容于100mL 容量瓶中，取一定體積溶液按照1.2.2 步驟測定，按照1.2.3 的公式計(jì)算總多酚提取率。

1.2.4.5 最佳工藝條件的選擇 為了得到閃式提取花生紅衣總多酚的最佳工藝條件，通過對乙醇濃度、料液比和提取電壓進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)分析，確定三因素三水平L9(33)(表1)實(shí)驗(yàn)，探究閃式提取花生紅衣總多酚的最佳工藝條件。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factor and coded levels in the orthogonal array design

1.2.5 測定溶液的配制 0.010mol/L 多巴溶液的配制:準(zhǔn)確稱取0.3900g 多巴，用蒸餾水溶解并定容至200mL 容量瓶中，將配好的溶液用錫紙包好避光，備用。

0.10mol/L 磷酸鹽緩沖溶液(pH =6.5)的配制:量取68.5mL 0.2mol/L 的磷酸二氫鉀和31.5mL 0.2mol/L三水合磷酸氫二鉀溶液，用蒸餾水定容至200mL，備用。

50U/mL 酪氨酸酶溶液的配制:準(zhǔn)確稱取5.2mg 965U/mg 的酪氨酸酶，用蒸餾水溶解定容至100mL容量瓶中，將配好的溶液置于黑暗處避光存放，備用。

將花生紅衣總多酚提取物、維生素C 和沒食子酸(GA)標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成質(zhì)量濃度為0.1mg/mL 的無水乙醇溶液。將DPPH·配成質(zhì)量濃度為1.0mg/mL的無水乙醇溶液。

1.2.6 提取物對酪氨酸酶活性的抑制率計(jì)算［11-12］按照如下公式計(jì)算花生紅衣總多酚對酪氨酸酶的抑制率:

式中，A1是加酪氨酸酶，不加提取液，加多巴溶液時(shí)的吸光度;A2是加酪氨酸酶，不加提取液，不加多巴溶液時(shí)的吸光度;A3是加酪氨酸酶，加提取液，加多巴溶液時(shí)的吸光度;A4是加酪氨酸酶，加提取液，不加多巴溶液時(shí)的吸光度。

1.2.7 清除DPPH·的計(jì)算［13］根據(jù)公式計(jì)算清除率:

清除率(%)=［1-(Ai-Aj)/A0］×100

式中，Ai:樣液與DPPH·溶液混合后在最大吸收波長處的吸光度值;Aj是樣液與無水乙醇混合后在最大吸收波長處的吸光度值;A0是DPPH·在最大吸收波長處的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生紅衣總多酚閃式提取工藝

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1.1 乙醇濃度對花生紅衣提取液中總多酚含量的影響 固定提取時(shí)間2min，料液比1∶20，提取電壓90V，稱取花生紅衣粉末各2.0000g，分別用0%、20%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液提取。結(jié)果如圖1 所示，隨著乙醇濃度的增大，總多酚提取率不斷提高，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時(shí)，花生紅衣總多酚的提取率最高，這與花生紅衣總多酚提取液中，多酚類物質(zhì)的極性有關(guān)。故在正交實(shí)驗(yàn)中選擇乙醇濃度為70%、80%、90%進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)考察。

圖1 乙醇濃度對總多酚提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of polyphenols extraction fficiency

2.1.1.2 料液比對花生紅衣提取液中總多酚含量的影響 固定提取時(shí)間2min，乙醇濃度為80%，提取電壓90V，稱取花生紅衣粉末各2.0000g，分別用1∶10、1∶15、1∶20、1∶15、1∶30 的料液比提取。結(jié)果如圖2 所示，花生紅衣總多酚的提取率隨著料液比的增大而提高，當(dāng)料液比達(dá)到1∶20 以后，花生紅衣總多酚的提取率趨于穩(wěn)定。這與提取液體積增大，蒸發(fā)濃縮的能耗等會相應(yīng)增大，綜合考慮各個(gè)因素，故選擇料液比為1∶15、1∶20、1∶25 進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)考察。

圖2 料液比對總多酚提取率的影響Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on the yield of polyphenols extraction efficiency

2.1.1.3 提取電壓對花生紅衣提取液中總多酚含量的影響 固定提取時(shí)間為2min，乙醇濃度為80%，料液比1∶20，稱取花生紅衣粉末各2.0000g，分別用80、85、90、95、100V 的電壓提取。結(jié)果如圖3 所示，花生紅衣總多酚的提取率隨提高電壓的增大而增高，當(dāng)電壓達(dá)到90V 時(shí)，提取率達(dá)到最大，而電壓大于90V時(shí)，總多酚提取率略微降低。可能由于隨著功率的增大，閃式提取器的刀頭轉(zhuǎn)速加大，產(chǎn)生熱量，使多酚類物質(zhì)發(fā)生氧化或分解，導(dǎo)致總多酚的提取率有所降低。故選擇提取電壓為85、90、95V 進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)考察。

圖3 提取電壓對總多酚提取率的影響Fig.3 Effect of voltage on the yield of polyphenols extraction efficiency

2.1.1.4 提取次數(shù)對花生紅衣提取液中總多酚含量的影響 固定提取時(shí)間2min，乙醇濃度為80%，料液比1 ∶20，提取功率90V，稱取花生紅衣粉末各2.0000g，對花生紅衣進(jìn)行1、2、3、4 次提取。結(jié)果如圖4 所示，隨著提取次數(shù)的增加，花生紅衣總多酚提取率依次增加，提取3 次以后，提取率增加平緩，故選擇提取次數(shù)為3 次。

2.1.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化閃式提取花生紅衣總多酚的工藝條件。每次花生紅衣粉末用量為2.0000g，采用L9(33)正交因素水平表(見表1)，設(shè)計(jì)L9(33)正交實(shí)驗(yàn)(表2)進(jìn)行提取。

圖4 提取次數(shù)對總多酚提取率的影響Fig.3 Effect of Extraction times on the yield of polyphenols extraction efficiency

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2 和表3 所示，影響花生紅衣總多酚提取率的因素順序?yàn)锽 ＞A ＞C，即料液比＞乙醇濃度＞提取電壓。綜合考慮確定最佳提取條件為A2B3C2，即乙醇濃度為80%，料液比為1∶25，提取電壓90V。在最佳提取條件下，提取3 次，花生紅衣總多酚平均提取率為96.94%，RSD =2.06%，(n =3)。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal array design matrix and experimental results

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis

2.2 花生紅衣總多酚對酪氨酸酶活性的影響

35℃恒溫條件下，向10mL 比色管中加入2.0mL酪氨酸酶溶液，3.5mL 的磷酸鹽緩沖液，再分別加入總多酚濃度為3.464mg/mL 的溶液0.2、0.5、0.8、1.1、1.4、1.7、2.0、1.5、2.5mL，最后加入2.0mL 多巴，定容，恒溫2min，在475nm 處測定吸光度，按1.2.6 的方法計(jì)算花生紅衣總多酚對酪氨酸酶的抑制率。

結(jié)果表明，花生紅衣總多酚對酪氨酸酶有較好的抑制作用，并且隨著總多酚濃度的增大，抑制率隨之增大，當(dāng)總多酚增大到一定濃度時(shí)抑制率增大平緩，抑制率達(dá)到50%的總多酚的質(zhì)量濃度(IC50)為0.451mg/mL。

圖5 花生紅衣總多酚對酪氨酸酶的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of Polyphenols from Peanut Testa on activity of tyrosinase

2.3 花生紅衣總多酚對DPPH·清除能力的測定

DPPH·是一種人工合成的穩(wěn)定自由基，其乙醇溶液顯紫色，在517nm 處有最大吸收。以無水乙醇為對照，精確吸取1.0mL DPPH·溶液與1.0mL 無水乙醇于10mL 比色管中，定容，搖勻后放置30min，測定上述溶液在最大吸收波長下的吸光度A0。精確吸取體積為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL 樣液，加入1.0mg/mL 的DPPH·溶液1.0mL，定容，搖勻后放置30min，測定上述溶液在最大吸收波長下的吸光度得Ai值，同理可測得Aj值，按照1.2.7 的方法計(jì)算清除率。

由圖6 可知，VC、沒食子酸、花生紅衣總多酚均具有較好的清除DPPH·的作用，清除率達(dá)到50%的質(zhì)量濃度分別為10.26、3.68、4.61μg/mL。結(jié)果表明花生紅衣總多酚清除DPPH·的能力大于VC，稍弱于沒食子酸。

圖6 不同抗氧化劑對DPPH 自由基的清除活性Fig.6 Scavenging rates of different antioxidants on DPPH free radicals

3 結(jié)論

3.1 通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)得閃式提取最佳工藝條件為乙醇濃度為80%，料液比為1∶25，提取電壓為90V，影響因素大小順序?yàn)榱弦罕龋疽掖紳舛龋咎崛‰妷?。該工藝具有提取時(shí)間短、提取效率高、安全可靠等優(yōu)點(diǎn)。

3.2 花生紅衣總多酚具有較好的抑制酪氨酸酶活性的作用，IC50為0.451mg/mL;具有較強(qiáng)的清除DPPH·的能力，抗氧化強(qiáng)弱順序?yàn)闆]食子酸＞花生紅衣總多酚＞VC。因此，花生紅衣總多酚在化妝品、食品及保健品等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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