馬 萌，周惠明 ，朱科學(xué)，彭 偉

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122)

菱角在我國有2000 多年的栽培歷史，原產(chǎn)于我國南方，現(xiàn)已擴(kuò)種至北京、天津一帶，但以長江下游和珠江三角洲以及山東內(nèi)湖等地載培較為集中，每年的菱角種植面積約為40000m2，年產(chǎn)量超過24 萬t［1］。菱角的藥用價(jià)值較高［2］，關(guān)于菱角的藥理功能已有很多報(bào)道，主要集中在菱角殼藥用成分的提取分離和應(yīng)用。由于菱角生長速度快且產(chǎn)量高，因此每年會(huì)產(chǎn)出大量的菱角，但除了用作藥用成分提取，少量被栽培區(qū)人們直接食用外，菱角肉的消費(fèi)量很低，帶來巨大的資源浪費(fèi)。由于菱角肉中的主要成分是淀粉和蛋白，淀粉含量在80%左右，蛋白含量在10%以上，而目前國內(nèi)外對菱角的研究主要集中在菱角殼中藥用成分的抗癌作用［3］和不同地域的菱角淀粉基本性質(zhì)的研究［4-7］，關(guān)于菱角淀粉與蛋白分離精制的研究相對較少，尤其在菱角蛋白的研究上目前尚未見報(bào)道。如果能將菱角中的淀粉和蛋白充分提取并研究其特性，對菱角的綜合利用和附加值的提高將會(huì)有重要的意義。由于前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菱角蛋白水溶性好，多為可溶性蛋白，根據(jù)這一特性，本研究借助物理分離方法對菱角粉中的蛋白和淀粉進(jìn)行分離，制備食品級菱角淀粉和菱角蛋白，并對其基本性質(zhì)進(jìn)行了初步分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菱角肉 山東省微山縣湖產(chǎn)品加工總廠，去皮曬干后的初成品;馬鈴薯淀粉、玉米淀粉 國民淀粉;無水乙醇、氫氧化鈉、乙酸、碘化鉀、碘 AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;膠體磨 無錫赫普輕工設(shè)備有限公司;UV-2800 型紫外可見分光光度計(jì) 上海分析儀器廠;RJ-LDL-50G 低速大容量多管離心機(jī) 江蘇無錫瑞江離心機(jī)廠;D8 Advance 型X-射線衍射儀 德國Bruker AXS 公司;Mastersize 2000 激光衍射粒度分析儀 英國馬爾文儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菱角肉基本成分測定 食品中水分測定GB5009.3-2010;油脂含量測定GB/T5009.3-2003;蛋白含量測定GB5009.5 -2010;灰分含量測定GB 5009.4-2010;淀粉含量測定GB/T5009.9-2008;纖維含量測定GB/T5009.10-2003。

1.2.2 菱角淀粉和蛋白的制備［8-10］原料是新鮮菱角去皮曬干后的初成品，稱取0.5kg，清洗浸泡后，采用粉碎機(jī)粗磨，然后用膠體磨細(xì)粉碎一定時(shí)間，乳漿過100 目篩去除纖維等雜質(zhì)，得到的淀粉乳用清水浸泡一定時(shí)間，收集上層液，以5000r/min 離心20min。淀粉沉淀55℃烘箱干燥12h 后過100 目篩，收集淀粉密封保存;蛋白溶液通過低溫濃縮和噴霧干燥制得菱角蛋白。

圖1 菱角淀粉和菱角蛋白制備工藝流程圖Fig.1 The preparation process flow diagram of the Water caltrop starch and protein

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 在浸泡時(shí)間6h，5000r/min 離心20min 條件下，粉碎時(shí)間(5、10、15、20、25、30、35s)對分離效果的影響情況;在粉碎時(shí)間20s，5000r/min 離心20min 條件下，不同浸泡時(shí)間(2、4、6、8、10、12、14h)對分離效果的影響情況;在粉碎時(shí)間25s，浸泡時(shí)間8h，5000r/min 離心分離條件下，離心分離時(shí)間(5、10、15、20、25、30、35min)對分離效果的影響情況。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 1 The design table of orthogonal tests

1.2.5 淀粉提取率的計(jì)算 根據(jù)公式計(jì)算淀粉提取率(%)=M1/M2×100

式中:M1為100g 的原料經(jīng)提取所能得到的最終產(chǎn)品菱角淀粉的干重;M2為100g 原料中淀粉的質(zhì)量。

1.2.6 淀粉顆粒粒度分布和直鏈淀粉含量的測定［11］采用Microtrac S3500 型激光粒度分析儀來測定樣品的粒徑分布。測定范圍0.020～2000μm，數(shù)據(jù)采用Microtrac S3500 相關(guān)軟件分析。

直鏈淀粉含量的測定采用碘比色法［12］。

1.2.7 淀粉結(jié)晶特性的測定 采用Bruker D8 X-射線衍射儀進(jìn)行測定，測定條件如下:特征射線Cu 靶，電壓為40kV，電流為40mA，起始角度3°，終止角度60°，步長0.02°，掃描速度為4°/min，發(fā)散狹縫1mm，防發(fā)散狹縫1mm，接受狹縫0.1mm，根據(jù)得到的X 射線衍射圖譜參照Komiya 和Nara 的方法［13］計(jì)算結(jié)晶度。

1.2.8 SDS-PAGE 凝膠電泳 參照Laemmli［14］，朱科學(xué)［15］等人的方法，電泳儀為DYY-6B 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀。分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%，電泳穩(wěn)壓100V 操作。采用雞蛋清溶菌酶(14.4ku)、胰蛋白酶抑制劑(20.1ku)、牛碳酸酐酶(31.0ku)、兔肌動(dòng)蛋白(43.0ku)、牛血清白蛋白(66.2ku 和兔磷酸化酶B(97.4ku)作為相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。溴酚藍(lán)為指示劑，其遷移率為1.0。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量與其相對遷移率的關(guān)系作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品中蛋白組分的分子量。

2 結(jié)果與討論

2.1 菱角肉基本成分測定結(jié)果

從表2 中可以看出，菱角肉中的主要成分是淀粉和蛋白，其中淀粉含量為78.99%，占菱角肉的主要部分，蛋白含量也很豐富，達(dá)到15.86%，粗脂肪含量很少，不到1%，其它成分含量同樣很少。由此可以推測，菱角肉中可利用度最高的成分是菱角淀粉和菱角蛋白，而對菱角肉加工品質(zhì)影響最大的同樣是其中含量最高的淀粉和蛋白。

表2 菱角肉基本成分測定結(jié)果(干基)Table 2 Basic components of Water caltrop

2.2 粉碎時(shí)間對菱角淀粉分離效果的影響

由圖2 可知，隨著粉碎時(shí)間的延長，菱角淀粉得率呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，在粉碎時(shí)間為20s 時(shí)提取率最高為93.15%;而菱角淀粉中蛋白含量則隨著粉碎時(shí)間的延長呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢，當(dāng)粉碎時(shí)間為15s 時(shí)，菱角淀粉中的蛋白含量最低為0.37%。由圖3 可知，菱角蛋白含量隨著粉碎時(shí)間的延長呈現(xiàn)先增加后下降趨勢，當(dāng)粉碎時(shí)間為20s 時(shí)，蛋白純度可到最高，為94.32%。綜合分析，粉碎時(shí)間在15～25s之間，菱角淀粉得率最高，淀粉中蛋白含量最低，菱角蛋白純度可達(dá)最高，菱角淀粉和蛋白的分離效果最佳。

圖2 粉碎時(shí)間對菱角淀粉品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of grinding time on the quality of water caltrop starch

2.3 浸泡時(shí)間對菱角淀粉分離效果的影響

圖3 粉碎時(shí)間對菱角蛋白純度的影響Fig.3 Effect of grinding time on the purity of water caltrop protein

由圖4 可知，隨浸泡時(shí)間的延長，菱角淀粉提取率和淀粉中蛋白含量均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。當(dāng)浸泡時(shí)間為4h 時(shí)，菱角淀粉提取率的下降趨勢基本趨于平緩，此時(shí)淀粉提取率為91.12%;當(dāng)浸泡時(shí)間為8h 時(shí)，淀粉中蛋白含量低于0.5%且趨于穩(wěn)定，此時(shí)為0.42%。由圖5 可知，菱角蛋白的純度隨浸泡時(shí)間的延長逐漸升高，在浸泡8h 時(shí)趨于穩(wěn)定，在12h 時(shí)達(dá)到最大值為93.13%。綜合分析，浸泡時(shí)間在8h 時(shí)，菱角淀粉提取率和淀粉中蛋白含量趨于穩(wěn)定，淀粉中蛋白含量達(dá)到要求，而蛋白純度基本達(dá)到最大值。

圖4 浸泡時(shí)間對菱角淀粉品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of soak time on the quality of water caltrop starch

圖5 浸泡時(shí)間對菱角蛋白純度的影響Fig.5 Effect of soak time on the purity of water caltrop protein

2.4 離心分離時(shí)間對分離效果的影響

由圖6 可知，隨著離心分離時(shí)間的延長，淀粉得率逐漸上升，淀粉中蛋白含量也呈現(xiàn)緩慢增加的趨勢。當(dāng)離心分離25min 時(shí)，淀粉提取率基本穩(wěn)定為93.23%;淀粉中蛋白含量基本穩(wěn)定，當(dāng)分離時(shí)間大于35min 時(shí)，蛋白含量高于0.5%。由圖7 可知，隨著離心分離時(shí)間的延長，菱角蛋白純度逐漸升高，在25min 時(shí)趨于最大值，為93.57%。綜合分析，離心分離時(shí)間選在20～30min 之間，菱角淀粉和蛋白分離效果和純度達(dá)到最佳。

圖6 離心分離時(shí)間對菱角淀粉品質(zhì)的影響Fig.6 Effect of centrifugal separation time on the quality of water caltrop starch

圖7 離心分離時(shí)間對菱角蛋白純度的影響Fig.7 Effect of centrifugal separation time on the purity of water caltrop protein

2.5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可得(表3):菱角淀粉得率較優(yōu)組合為A2B1C2，菱角淀粉提取率為92.1%;菱角蛋白純度較優(yōu)組合為A2B2C2;通過極差分析，正交實(shí)驗(yàn)中三個(gè)工藝參數(shù)對菱角蛋白純度的影響浮動(dòng)程度較大，而對菱角淀粉的提取率影響相對較小，因此重點(diǎn)分析各因素水平對菱角蛋白純度的影響。由于菱角蛋白制備工藝較優(yōu)組合未在正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)，所以需要對較優(yōu)組合進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

由正交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果可得(表4)，較優(yōu)組合A2B2C2并不是菱角蛋白純度最高的最優(yōu)組合，A2B2C3為最優(yōu)組合。最優(yōu)組合工藝條件為:粉碎時(shí)間20s，浸泡時(shí)間8h，離心分離時(shí)間30min，該條件下菱角蛋白純度為93.9%，菱角淀粉提取率為91.8%。

2.6 菱角淀粉顆粒粒度分布及直鏈淀粉含量

菱角直鏈淀粉含量17.11%，介于馬鈴薯淀粉和玉米淀粉之間。淀粉中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量對淀粉的糊化溫度、溶解度、粘度等性質(zhì)均有影響。菱角中直鏈淀粉含量較高。

菱角淀粉80%的顆粒粒徑在15.52～26.88μm 之間，比馬鈴薯淀粉和玉米淀粉的粒徑都小。淀粉顆粒的大小直接影響到淀粉的結(jié)晶性質(zhì)，直鏈與支鏈淀粉的比例，糊化性質(zhì)，流變學(xué)性質(zhì)，消化性質(zhì)，改性效果以及熱力學(xué)性質(zhì)等［16］。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiments

表4 正交實(shí)驗(yàn)較優(yōu)組合驗(yàn)證結(jié)果Table 4 Validation results of the optimum combination

2.7 菱角淀粉結(jié)晶特性

從圖8 可以得出，馬鈴薯淀粉屬于典型的B 型淀粉，在2θ 為5.6°、17.1°、22.1°和24.1°左右均有明顯衍射峰，而菱角淀粉與玉米淀粉相同，在2θ 為15.2°、17.1°、18°和23.1°左右有明顯衍射峰，且衍射峰強(qiáng)度強(qiáng)，屬于A 型高結(jié)晶型淀粉，在特征峰處菱角淀粉的衍射強(qiáng)度大于玉米淀粉?；贙omiya 和Nara 的方法計(jì)算結(jié)晶度得出，菱角淀粉的結(jié)晶度(36.47%)大于馬鈴薯淀粉(29.88%)和玉米淀粉(34.34%)。

圖8 淀粉的X-射線衍射圖譜Fig.8 X-ray diffraction patterns of starches

2.8 菱角蛋白分子量分布

對菱角蛋白的分子量進(jìn)行了分析(見圖9)。泳道1 是標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，泳道2 是菱角蛋白。

由圖9 可見，菱角蛋白經(jīng)過電泳后主要得到7 條區(qū)帶，分子量分別為:14.5、17.5、19.0、22.5、37.2、45.8、68.2ku，且主要分布在17.5 與37.2ku 左右。由此可以看出，菱角蛋白多為小分子蛋白，分子量較小。

圖9 菱角蛋白的SDS-PAGE 電泳圖譜Fig.9 SDS-PAGE patterns of water caltrop protein

3 結(jié)論

本研究對菱角中的主要成分進(jìn)行了分析，并且采用物理方法，將菱角中的主要成分淀粉和蛋白充分分離利用，確定了菱角淀粉和菱角蛋白分離提取的最優(yōu)工藝條件:粉碎時(shí)間為20s，浸泡時(shí)間為8h，離心分離時(shí)間為30min。該條件下菱角淀粉提取率為91.8%，菱角蛋白純度為93.9%。初步研究了淀粉和蛋白的基本性質(zhì)，得出:菱角淀粉體積平均粒徑為20.86μm，結(jié)晶度為36.47%，屬于A 型淀粉;菱角蛋白的分子量主要分布在17.5、37.2ku 左右，為菱角資源的綜合利用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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