趙 娜，薩如拉，郭 軍，烏云達來

(內蒙古農業(yè)大學食品科學與工程學院，內蒙古呼和浩特010018)

乳酸菌既能賦予產品優(yōu)良的感官性質，增加發(fā)酵食品的安全性，又能部分抑制原材料中腐敗微生物和致病菌的生長［1］，產生具有抑菌或殺菌效果的有機酸、過氧化氫、雙乙酰和細菌素等［2］。細菌素是細菌產生的一種抗菌物質，它是在代謝過程中通過核糖體合成機制產生的一類具有抗菌活性的多肽或前體多肽，抗菌對象主要是產生菌分類上相近的細菌［3-4］。近幾十年，已經從乳桿菌中分離出十幾種細菌素，而且不斷有新的乳桿菌素被分離出來［5］，如植物乳桿菌細菌素BacTN635［6］、嗜酸乳桿菌細菌素TS1［7］等。隨著研究的深入，人們把陸續(xù)發(fā)現的一些不符合或不完全符合細菌素定義的拮抗物質稱為類細菌素［8-9］。類細菌素對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌等都具有抑制作用［10］，其抗菌譜比細菌素更廣，這一特性決定了它具有比細菌素更廣泛的應用前景［11］。本文從分離自內蒙古地區(qū)傳統(tǒng)乳制品的乳酸菌中篩選出一株廣譜抗菌活性瑞士乳桿菌AJT，對其抗菌物質特性進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

瑞士乳桿菌AJT 分離自內蒙古地區(qū)傳統(tǒng)乳制品;指示菌 為實驗室保藏菌株(見表3);脫脂乳培養(yǎng)基、MRS 液體培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、PDA 培養(yǎng)基 根據文獻［12］方法配制;0.45、0.22μm 微孔濾膜 購自天津東康科技有限公司;胃蛋白酶 購自SIGMA-ALDRICH 公司;胰蛋白酶 購自AMRESCO公司;木瓜蛋白酶(德國進口分裝) 購自國藥集團化學試劑有限公司;蛋白酶K 購自上海江萊生物科技有限公司;過氧化氫酶 購自西安國安生物科技有限公司。

超凈工作臺ZHJH-C1214C 南京依貝儀器設備有限公司;立式壓力滅菌器YXQ-LS-30 SII 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;pH 計PB-10 Sartorius 集團;電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP-9082 上海一恒科技有限公司;恒溫水浴鍋JC-HH-S26濟南精誠實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵液的制備 將真空干燥保存的菌株AJT于脫脂乳培養(yǎng)基中活化1～2 代，接種于MRS 液體培養(yǎng)基，活化3 代。按2%體積比接種于50mL MRS 液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，8000r/min 離心10min，取上清液0.45μm 濾菌器過濾除菌，冷藏備用。

1.2.2 指示菌的培養(yǎng) 將大腸桿菌等細菌用營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基37℃培養(yǎng);真菌用PDA 斜面培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 菌株AJT 抗菌活性測定 將菌株AJT 按體積比例2%接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，每隔2h 測其OD600nm及pH，將菌液8000r/min 離心10min，0.22μm濾菌器濾菌后以大腸桿菌ACCC 10145 做指示菌，通過牛津杯法測定其抗菌活性，實驗進行三個平行。

1.2.4 抗菌物質的提取 根據抗菌物質產生情況，取抗菌物質活性最佳時的發(fā)酵上清液200mL，60℃濃縮至50mL 左右，用乙酸乙酯萃取搖瓶過夜，靜置6h 后取上層低溫干燥，沉淀用甲醇抽提［13］2 次，8000r/min 離心10min，上清液經真空低溫干燥，得到的沉淀用滅菌蒸餾水溶解后即為抗菌物質提取液，將其4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 酸抑制作用的排除 乳酸菌在代謝過程中能產生多種具有抑菌活性的產物，包括酸性物質、CO2、H2O2、細菌素及類細菌素等［14］。為排除酸性末端產物的干擾，用2mol/L NaOH 將抗菌物質提取液pH 調節(jié)為5.0，以乳酸和乙酸調節(jié)pH 至5.0 的滅菌蒸餾水作對照，進行牛津杯法抑菌實驗。

1.2.6 過氧化氫干擾的排除 乳酸菌代謝產生的過氧化氫也可抑制細菌的生長，尤其是抑制革蘭氏陰性菌的生長［15］。取1mL 抗菌物質提取液，加入過氧化氫酶，使其終濃度達1mg/mL，以未經過氧化氫酶處理的抗菌物質提取液作為對照，37℃水育24h，以大腸桿菌做指示菌，測定抗菌活性。

1.2.7 抗菌物質的熱穩(wěn)定性 將抗菌物質提取液分別在-37、-20、37、60、90、100、121℃條件下處理30min，以4℃保存的提取液作對照，進行牛津杯抑菌實驗，比較抑菌活性強弱。

1.2.8 抗菌物質的pH 穩(wěn)定性 取等量的菌株AJT的抗菌物質提取液，用1mol/L HCl 和2mol/L NaOH分別調節(jié)pH 至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，以未處理的提取液作為對照，測定抑菌活性。

1.2.9 抗菌物質的蛋白酶敏感性 取4 份抗菌物質提取液，用1mol/L HCl 和2mol/L NaOH 分別調節(jié)至胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K 和木瓜蛋白酶的最適pH(依次為7.4、2.0、7.4 和6.0)，按終濃度1.0mg/mL加入各酶液，37℃反應2h 后，沸水處理5min。將pH調回到原始值，以未處理的提取液作對照，進行抑菌實驗。

1.2.10 抗菌物質的紫外線敏感性 取4 份等量抗菌物質提取液，0.22μm 濾菌器濾菌，取三份提取液平鋪于滅菌平皿，于40W 紫外燈下分別輻照10、30、120min，另外一份作為對照，測定抑菌活性。

1.2.11 抗菌物質的抑菌譜 用不同的革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌做指示菌，進行牛津杯擴散抑菌實驗，每支牛津杯加入200μL 抗菌物質提取液［16］。

1.2.12 數據處理 用軟件DPS v6.55 進行數據分析。

2 結果與討論

2.1 菌株AJT 抗菌活性測定

將瑞士乳桿菌AJT 按2% 體積比接種于起始pH6.5 的MRS 液體培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)60h 的生長曲線及抑菌活性曲線見圖1。由圖1 可知，菌株AJT培養(yǎng)至2h 即進入對數生長期，12h 左右進入穩(wěn)定期;pH 于培養(yǎng)4h 顯著下降，16h 后趨于穩(wěn)定，從整個發(fā)酵過程可以看出菌株AJT 產酸能力較強，最終pH 穩(wěn)定在3.8 左右。從對數期前期(6h)開始，菌株AJT 具有抗菌活性，這與瑞士乳桿菌G51 類似［17］。進入穩(wěn)定期(12h)后抗菌物質產量持續(xù)增加，穩(wěn)定期中期(20h)抗菌物質活性達到最高水平，之后抑菌活性稍微有所下降，故后期抗菌物質研究中以發(fā)酵20h 的發(fā)酵液為研究對象，這一特性與短乳桿菌FPTLB3 所產抗菌物質特性類似，菌株FPTLB3 抑菌活性在19h時達到最大值［18］。

圖1 菌株AJT 生長曲線及抑菌活性測定Fig.1 Production profile of the active antimicrobial substance produced by Lactobacillus helveticus AJT

2.2 酸抑制作用的排除

乳酸菌在代謝過程中可能會產生酸性抑菌物質，如乳酸、乙酸和其他有機酸類，為排除酸性末端產物干擾，將菌株AJT 的抗菌物質提取液pH 調節(jié)至5.0，與乳酸和乙酸調節(jié)pH 至5.0 的滅菌蒸餾水對比，以大腸桿菌做指示菌，進行抑菌實驗。結果如表1 所示，pH5.0 的抗菌物質提取液抑菌活性依然很強，而pH5.0 的乳酸、乙酸不顯示抑菌活性。故菌株AJT 的抗菌物質提取液排除酸性末端產物的干擾后，仍存在其他的抑菌活性物質。

2.3 過氧化氫作用的排除

乳酸菌在代謝過程中可能產生過氧化氫，也能抑制其他細菌的生長，故應排除過氧化氫的干擾。設置對照組的排除過氧化氫實驗結果見圖2，用過氧化氫酶處理的抗菌物質提取液與對照組的抑菌圈直徑大小接近，故排除抗菌活性由過氧化氫所致。

表1 酸抑制作用的排除Table 1 Eliminate the effect of organic acids

圖2 過氧化氫作用的排除Fig.2 Eliminate the effect of hydrogen peroxide

2.4 抗菌物質的熱穩(wěn)定性

將等量抗菌物質提取液在不同的溫度下處理30min，以4℃保存的提取液做對照，抑菌實驗結果見圖3，經不同溫度處理后的樣品抑菌圈直徑大小無顯著差異，說明菌株AJT 所產抗菌物質具有熱穩(wěn)定性。

圖3 不同溫度對抗菌物質的影響Fig.3 Effect of temperature on the inhibitory activity of antibacterial substance

2.5 抗菌物質的pH 穩(wěn)定性

分別調節(jié)至不同pH 的抗菌物質水溶液和未經處理的抗菌物質水溶液的抑菌實驗，結果如圖4 所示，抗菌物質的有效抑菌pH 范圍為2.0～5.0，在pH2.0 時，抑菌圈直徑最大，隨著pH 增大，抑菌圈直徑逐漸下降，至pH6.0 時完全失去抑菌活性。由于原始提取液的pH 為3.04，所以對照的抑菌圈直徑與調節(jié)pH 至3.0的樣品的抑菌圈直徑大小相當。

2.6 抗菌物質的蛋白酶穩(wěn)定性

圖4 pH 對抗菌物質活性的影響Fig.4 Effect of pH on the inhibitory activity of antibacterial substance

將抗菌物質水溶液經不同蛋白酶處理后滅酶，然后進行牛津杯擴散抑菌實驗，結果如圖5 所示。與對照比較，經蛋白酶處理后的抗菌物質的抑菌活力均顯著下降，但仍然具有很強的抑菌活性，表明該提取液中抗菌物質為蛋白類或非單一抗菌物質組成，具體成分有待進一步分析確定。

圖5 抗菌物質的蛋白酶敏感性Fig.5 Inhibitory activities of antimicrobial substance after being treated by protease

2.7 抗菌物質的紫外線敏感性

在40W 紫外燈下輻照10、30、120min 的抗菌物質水溶液及未處理樣品的抑菌活性見表2，經紫外線輻照不同時間的抗菌物質提取液抗菌活性與對照的抗菌活性無顯著差異，說明菌株AJT 所產抗菌物質對紫外線不敏感。

表2 抗菌物質的紫外線敏感性Table 2 Inhibitory activities of antimicrobial substance after being treated by UV

2.8 抗菌物質的抑菌譜

通過以不同的革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及真菌做指示菌，進行牛津杯擴散抑菌實驗，得到菌株AJT 所產抗菌物質的抑菌譜，見表3:

由表3 可以得出，菌株AJT 產生的抗菌物質對所選的指示菌均顯示了抗菌活性，其中對大腸桿菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、少孢根霉顯示了很強的抗菌活性，抑菌圈直徑30mm 以上;對金黃色葡萄球菌、熒光假單胞桿菌、擴展青霉、煙曲霉、黃色鐮刀菌顯示了較強的抗菌活性，抑菌圈直徑20mm 以上;但其對米曲霉的抗菌活性較弱。瑞士乳桿菌AJT 產生的抗菌物質的抑菌譜，與已報道的類細菌素的抗菌譜類似，如嗜酸乳桿菌產生的類細菌素Lactobacillin NX2-6，也對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌具有較強的抑制作用［19］;乳酸菌SD-22 產生的類細菌素Lactobacillus SD-22，對革蘭氏細菌及部分真菌有明顯的抑制作用［15］。由于細菌素的定義存在多種說法，對類細菌素的歸屬也缺乏一個統(tǒng)一的標準［20］。根據目前已報道的細菌素和類細菌素的特性區(qū)別，基于瑞士乳桿菌AJT 所產抗菌物質的抗菌譜及熱穩(wěn)定等特性，初步將菌株AJT 產生的抗菌物質歸為類細菌素。

表3 菌株AJT 抗菌物質的抑菌譜Table 3 Antimicrobial spectrum of Lactobacillus helveticus AJT

3 結論

從內蒙古地區(qū)傳統(tǒng)乳制品中分離到的廣譜抗菌活性瑞士乳桿菌AJT，其產生的抗菌物質排除酸和過氧化氫的抗菌作用后，對熱穩(wěn)定，在pH2.0～5.0 有較強活性，對胃蛋白酶等蛋白酶敏感，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌均具有抗菌活性。尤其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等常見致病細菌和少孢根霉、擴展青霉等真菌具有明顯的抑制作用，因此，其在食品保藏及農業(yè)、畜牧業(yè)等方面具有潛在應用能力。

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