童靜靜，章元炳，葉再鐲，馮鳳琴，*

(1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058;2.寧波超星海洋生物制品有限公司，浙江寧波315000)

海參(sea cucumber，Ludwigothurea grisea)屬棘皮動物門、海參綱動物，根據(jù)海參的外部特征，將其分為四個目九個科(枝手目:瓜參科、沙雞子科、高球參科;楣手目:辛那參科、海參科、刺參科;芋參目:芋參科;無足目:錨海參科、指參科)。全世界約有1100種海參，其中40 種可食用，我國有100 多種，其中20多種可食用［1］。干制的海參蛋白質(zhì)的成分很高，接近90%，多糖6%左右，脂質(zhì)約占4%，含有少量核酸以及鈣、鎂、鐵、錳、鋅、銅、鉬、硒等微量元素［2］。不同種類的海參由于生長環(huán)境的不同，其營養(yǎng)價值和生物活性也有所差異，其中以刺參營養(yǎng)價值最高，屬于海參中的精品，被稱為“參中之冠”［2］。自古以來，海參作為營養(yǎng)食品和保健食品被廣泛使用，海參常被制成海參干粉、海參熟制品、海參罐頭等，大量的應(yīng)用是把海參作為食品原料進(jìn)行簡單的初級加工。海參多肽是以新鮮海參為原料，經(jīng)過蛋白酶酶解，分離純化得到的具有功能特性的生物活性物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)海參多肽具有抗氧化、降血壓、抗腫瘤、抗疲勞等多種功能。本文主要對海參多肽的生物活性以及制備分離純化方法進(jìn)行介紹，為海參多肽在食品、醫(yī)藥、保健品等行業(yè)的應(yīng)用提供依據(jù)和思路。

1 海參多肽的生物活性

1.1 抗氧化活性

生物體內(nèi)氧自由基(oxygen - derived free adicals.OFR)，主要包括超氧陰離子(O-2·)、羥自由基(·OH)、羥過氧自由基(HOO·)、有機(jī)過氧自由基(ROOy)等，在生物體內(nèi)不斷產(chǎn)生，也不斷地被分解，處于動態(tài)平衡之中，維持在一個正常的生理水平上。若體內(nèi)自由基過量，可損傷體內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸和生物膜，引起各種疾病。而自由基清除劑可清除體內(nèi)自由基，保護(hù)機(jī)體免受氧化損害。因此，近年來，對體內(nèi)自由基清除劑的研究備受關(guān)注，如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH - PX)、抗氧化劑谷胱甘肽(glutathione，GSH)和維生素等［3］。

1.2 降血壓活性

隨著人們生活水平的不斷提高，高蛋白、高脂肪的攝食越來越大眾化，高血壓的患病率也逐步上升。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Angiotension - Ⅰ- converting Enzyme，ACE)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-Angiotensnisystme，ARS)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(Kal1ikrein-KininSystme，KKS)的關(guān)鍵酶［11］，在ARS中，ACE 將無升壓活性的血管緊張素Ⅰ水解為具有升壓活性的血管緊張素Ⅱ，在KKS 中，ACE 使具有降壓活性的緩激肽降解失去降血壓活性。通過以上兩個途徑，ACE 參與體內(nèi)血壓調(diào)節(jié)，造成血壓的升高，引發(fā)高血壓［12］。

海參多肽作為一種有效的ACE 抑制劑，就是通過抑制血漿和血管內(nèi)皮細(xì)胞ACE 的活性從而達(dá)到降低血壓的目的的。有研究表明，分子量＜2ku 的海參多肽具有較強(qiáng)的ACE 抑制活性，其中海地瓜體壁蛋白水解物＜2ku 的多肽ACE 抑制活性的IC50值達(dá)0.615mg/mL［13］。不同酶的酶活和作用位點(diǎn)的不同導(dǎo)致酶解產(chǎn)物的分子量分布不同，影響其ACE 抑制活性。趙元暉等［14］比較了Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、3942 中性酶、Alcalase 2.4L 六種海地瓜蛋白水解液ACE 抑制活性的大小，結(jié)果表明:6 種蛋白酶水解液對ACE 抑制效果從大到小依次為:菠蘿蛋白酶水解液＞Ⅰ型膠原酶水解液＞Alcalase 酶水解液＞3942 中性酶水解液＞木瓜蛋白酶水解液＞胰蛋白酶水解液。Forghania［15］也比較了糙海參(Golden sea cucumber)六種不同酶酶解液的ACE 抑制活性的大小，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶酶解液具有最高的ACE 抑制活性，IC50達(dá)0.41mg/mL，其次為風(fēng)味蛋白酶，然后是菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶，最后為胰蛋白酶和復(fù)合蛋白酶。海地瓜酶解物經(jīng)過類蛋白反應(yīng)(類蛋白反應(yīng)是指利用濃縮的蛋白質(zhì)在合適的條件下經(jīng)蛋白酶的作用合成的類蛋白產(chǎn)品)修飾后，ACE 抑制活性能夠明顯升高［16］。ACE 抑制活性的大小主要與其ACE 抑制肽的C-末端氨基酸序列有關(guān)，其中主要與三肽序列有關(guān)，Monti 等［17］研究證實，ACE 抑制肽的C-末端三肽序列含疏水性氨基酸(芳香族氨基酸或帶支鏈氨基酸)，活性較強(qiáng)，若其中C-末端三肽序列中含有一個脯氨酸或者含有一個帶正電的氨基酸如賴氨酸(ε-氨基帶正電荷)、精氨酸(胍基帶正電荷)，其活性也會明顯增強(qiáng)。

1.3 其他生物活性

海參多肽除具有抗氧化和降血壓活性之外，還具有降血脂、抗疲勞、抗癌以及鎮(zhèn)痛等生物活性。Rodriguez 等［18-19］將從海參(Holothuria forskali)酶解液中提取的多肽喂養(yǎng)大鼠，檢測其對大鼠血脂的影響，結(jié)果顯示海參多肽在明顯升高血清高密度脂蛋白的含量的同時降低血清甘油三酯的的水平，從而達(dá)到降血脂的效果。王海濤等［20］研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)刺參(Apostichopus japonicus)多肽具有比較好的抗疲勞的效果，其作用機(jī)理主要為能夠顯著降低運(yùn)動后小鼠的血尿素氮含量以及提高其肝糖原含量，且功效隨著灌胃劑量的提高而增強(qiáng)。付學(xué)軍［21］進(jìn)一步研究了不同濃度的低分子量的海參肽對小鼠抗疲勞的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低分子量的海參肽對小鼠的體重沒有明顯的影響，具有顯著的抗疲勞作用。王奇等［22］也驗證了海參的抗疲勞活性，通過動物實驗還發(fā)現(xiàn)東海海參多肽能夠提高小鼠的記憶力，其作用機(jī)制可能是上調(diào)小鼠內(nèi)記憶相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。盧連華［23］和謝永玲［24］研究了海參肽對小鼠的免疫調(diào)節(jié)功能的影響，結(jié)果表明海參肽能夠增強(qiáng)小鼠體液免疫功能、非特異性免疫功能以及自然殺傷(HK)細(xì)胞。王奕［25］通過動物實驗研究日本刺參(Apostichopus japonicus)多肽的抗腫瘤作用，結(jié)果表明不同劑量組的日本刺參膠原蛋白多肽均能夠顯著抑制小鼠S180 肉瘤的生長。有研究還表明鮮海參的提取物對體外培養(yǎng)的人胃癌細(xì)胞棟(MGC)、人肝癌細(xì)胞株(7402)以及小鼠的乳腺肉瘤細(xì)胞棟(EMT6)的生長有顯著的抑制作用［26］。Shinichi 等［27］還從日本刺參中分離出一種五肽和七肽，其研究結(jié)果表明這兩種小分子的多肽能夠促進(jìn)生殖細(xì)胞的形成和卵母細(xì)胞的成熟。除此之外，Ridzwan［28］利用動物實驗證明玉足海參(Holothuria leucospilota)、圖紋白尼參(Bohadschia marmorata)的水提取物、糙刺參(Stichopus hermanii)的腹腔液都具有良好的鎮(zhèn)痛作用。海參多肽的多種生物活性正在逐漸被人們認(rèn)識，大量的動物實驗證明了海參作為保健品和功能食品的潛力。

2 海參多肽的提取、精制以及結(jié)構(gòu)鑒定

近年來，對于不同種類海參多肽的制取、精制已經(jīng)有較多的報道，但是對于其活性結(jié)構(gòu)的鑒定研究才剛剛開始。目前，海參多肽的制取常采用酶解法，制備不同生活活性的海參多肽選擇的酶也不盡相同，常采用復(fù)合蛋白酶和中性蛋白酶;精制主要圍繞脫鹽、脫色進(jìn)行，常用活性炭或者大孔樹脂物理吸附進(jìn)行脫色，柱層析進(jìn)行脫鹽，制備高商品性狀的產(chǎn)品。

2.1 海參多肽的制取

生物活性肽的生產(chǎn)方法主要包括從自然界中提取天然活性物質(zhì)、蛋白質(zhì)降解以及化學(xué)合成法［29］。其中，在海參多肽的制取過程中，應(yīng)用最成熟的技術(shù)為蛋白質(zhì)定向酶切，即利用不同的酶或者微生物對海參進(jìn)行蛋白質(zhì)降解獲得具有不同功能的生物活性多肽［30］。在酶解過程中，通過酶種類的選擇，酶解條件的控制(加酶量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、底物濃度)來得到具有特定生理功能的生物活性肽［31］。

向怡卉等［32］利用復(fù)合蛋白酶水解海參生殖腺，制得水解度達(dá)50%的海參蛋白液。水解度是衡量水解程度的一個重要指標(biāo)，水解度越高，水解得越徹底，但多肽的含量不一定高。因此，為了得到更高含量的多肽，張彧等［33］選擇多肽得率作為目標(biāo)來控制海參的酶解，得到多肽的得率為42%左右的海參多肽。海參多肽的肽鏈中含有羥基、氨基和羧基等多種親水基團(tuán)，能夠與水分子結(jié)合，是很好的吸濕劑，同時由于其分子量小，很容易被皮膚吸收，不但維持肌膚的吸水還具有良好的保濕效果，因此，其吸濕性和保濕性同樣受到人們的關(guān)注，朱洪珍等［34］選擇中性蛋白酶對海地瓜進(jìn)行酶解，得到吸濕率和保濕率分別為6.11%和81.23%的海地瓜膠原蛋白多肽。人們在研究選擇合適的外加酶進(jìn)行海參多肽的酶解的同時也在關(guān)注海參自身的酶對其酶解的影響。鄭杰等［35］的研究進(jìn)一步驗證了海參腸內(nèi)酶的作用，其研究表明，海參腸自溶水解物具有一定的DPPH·(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基)清除能力、Fe2+螯合能力和還原能力。結(jié)合之前的研究以及實際生產(chǎn)的需要，王靜等［36］將海參體內(nèi)酶與外加酶結(jié)合使用，將完整的海參勻漿后誘導(dǎo)其自溶，以自溶后水解液為底物，加入復(fù)合蛋白酶進(jìn)行二次水解，從而提高酶解效率，二次水解后海參多肽的得率從34%提高到約為60%。

2.2 海參多肽的精制

海參多肽的精制過程一般包括預(yù)處理、分離、純化和純度測定四個階段，其中純化是最為關(guān)鍵的階段。利用酶解法制備海參多肽的過程中主要存在著鹽含量過高、顏色過深等問題，因此海參多肽的純化主要圍繞著脫鹽、脫色進(jìn)行。在酶解過程中，根據(jù)不同的酶的最適pH，必須通過不斷的加酸或者堿來維持體系pH 的穩(wěn)定，因此水解物中含有一定量的鹽分，這些鹽分對海參多肽的理化性質(zhì)、適用范圍和生物活性產(chǎn)生影響。目前常用的脫鹽的方法有離子交換樹脂法、透析法和超濾法。王靜等［36］采用透析法和超濾法對刺參多肽進(jìn)行脫鹽純化，脫鹽率達(dá)到85%左右。海參體壁的大量色素經(jīng)過酶解沉積到海參多肽中，導(dǎo)致海參多肽顏色過深影響其開發(fā)利用，張翠玉等［37］研究了NKA-9、AB-8、D392、D280、D101、D315 六種不同的大孔樹脂對海地瓜多肽的脫色效果。結(jié)果表明:樹脂D392 可較好的用于海地瓜多肽的脫色，脫色率達(dá)到83.2%，多肽保留率為80.5%。海參經(jīng)過酶解得到多肽的分子量分布大約為500～3000u，分子量的不同對多肽的抗氧化性、ACE抑制活性等功能都有影響，分離并純化不同分子量范圍的多肽對研究其生物活性具有重要意義，目前常用的純化方法主要有:柱層析、高效液相色譜、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。趙元暉等［14］利用Sephadex G-25 凝膠柱層析、SP Sephadex C-25 陽離子交換層析、反相高效液相色譜層析對海地瓜復(fù)合酶水解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，得到兩種高活性、高純度的ACE 抑制肽。王洪濤等［38］將海參酶解液先經(jīng)過醇沉、離心分離海參多肽和蛋白，再對海參蛋白和多糖分別進(jìn)行純化，得到較高純度的海參多肽和多糖，使得海參的營養(yǎng)價值得到更好地應(yīng)用。

2.3 海參多肽的結(jié)構(gòu)鑒定

迄今為止，國內(nèi)外的學(xué)者主要對海參中的一些活性成分比如海參多糖的提取、分離純化以及結(jié)構(gòu)鑒定進(jìn)行了較多的報道，但是對于海參多肽的結(jié)構(gòu)組成的研究比較少。有研究表明，海洋多肽的生物活性與多肽的氨基酸序列、多肽的結(jié)構(gòu)、疏水性以及所帶的電荷有關(guān)［39］，因此測定海參多肽的結(jié)構(gòu)為我們更好的研究海參生物活性提供基礎(chǔ)。目前國外學(xué)者對氨基酸序列的測定做了大量的工作，Birenhenide［40］從海參中分離出兩種多肽，一種為Pro-Leu-Gly-Tyr-Met-Phe-Arg，另一種為Pro-Leu-Gly-Tyr-Met-Phe-Arg，屬于神經(jīng)肽類，主要影響海參真皮的硬度及彈性。Miranda［41］從海參(Holothuria glaberrima)中分離出兩種肽，一種為Gly-Phe-Ser-Lys-Leu-Tyr-Phe-NH2，命名為GFSKLYFamide，另一種為Ser-Gly-Tyr-Ser-Vak-Leu-Tyr-Phe-NH2，命名為SGYSVLYFamide，其中GFSKLYFamide 對海參神經(jīng)肌肉的結(jié)締組織有重要影響。Sunil Kumar 等［42］從海參(Caudina Arenicola)中分離出一種四肽，經(jīng)測定得出其結(jié)構(gòu)為Pro-Glu-Leu-Leu，是C 球蛋白的94-97 片斷。我國學(xué)者Liu Zunying 等［43］從巨型紅海參(Parastichopus californicus)中提取胃蛋白酶可溶性膠原蛋白屬于Ⅰ型膠原蛋白，但在氨基酸組成與Ⅰ型膠原蛋白有一些不同。趙元暉等［14］應(yīng)用納升電噴霧—四極桿—飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(Nano-ESI-Ms/Ms)技術(shù)，對從海地瓜中分離得到的ACE 抑制肽P1、P2進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。P1的精確分子量為1629.7u，氨基酸序列為YYLEMDFLLFNY;P2的精確分子量為1034.5u，氨基酸序列為MEGAQEAQGD。但是海參多肽的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)對其生物活性的具體影響機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

3 展望

近年來，海參多肽的研究取得了較大的進(jìn)展，但和某些功能性多肽的研究相比，還存在著一定的差距。對于不同種類海參多肽的提取條件的優(yōu)化、分離純化和生物活性等方面的研究已較為成熟，而其結(jié)構(gòu)測定和構(gòu)效關(guān)系的研究卻非常有限。目前，雖然人們對海參多肽的生理功能做了大量的研究，但是大部分研究比較淺顯，對具體的作用過程和作用機(jī)制了解的不夠詳細(xì)。此外，海參種類繁多，目前的研究也大部分局限在一些價格比較昂貴的海參品種上，比如刺參、糙參，還有其它品種的海參需要進(jìn)行進(jìn)一步的開發(fā)和利用。

今后，對海參多肽的研究主要著重于以下幾個方面:

不同海參多肽的結(jié)構(gòu)測定:從目前的研究來看，由于海參的種類繁多，不同種類海參多肽的結(jié)構(gòu)不同，不同水解程度得到的不同分子量的多肽的結(jié)構(gòu)也不同，從而增加了海參多肽結(jié)構(gòu)測定的難度。但是海參多肽的結(jié)構(gòu)是其生理功能的基礎(chǔ)，更深入的工作有待于進(jìn)一步開展。

海參多肽的修飾與構(gòu)效關(guān)系的研究:多肽的修飾可能導(dǎo)致其生物活性發(fā)生變化，比如多肽的修飾可以使活性低或者不具有活性的海參多肽具有較高的活性，因此對其構(gòu)效關(guān)系的研究有助于海參多肽以及其衍生物的制備。

海參多肽生物活性的作用機(jī)制的研究:目前對于海參多肽的生物活性的研究的文章較多，但只通過實驗報道了結(jié)果以及可能的作用機(jī)制。對于海參多肽作用機(jī)制的更全面系統(tǒng)的報道需要進(jìn)一步的探討。

應(yīng)用研究:進(jìn)一步開發(fā)其它種類的海參多肽，研究海參多肽的功能性成分的高效制取和分離純化，實現(xiàn)海參多肽的大規(guī)模生產(chǎn)，并應(yīng)用于食品和醫(yī)藥制品中，發(fā)揮其更加重要的作用。

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