袁麗紅，丁洪流，陳 英，姚衛(wèi)蓉，*

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；2.蘇州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，江蘇蘇州215104）

一直以來，偶氮甲酰胺（azodicarbonamide，簡(jiǎn)稱ADA）被認(rèn)為具有在低用量下實(shí)現(xiàn)安全快速氧化的效能，能改善面團(tuán)的物理操作性質(zhì)，使得面團(tuán)中形成高筋力面團(tuán)所需的組織結(jié)構(gòu)，適用于做小麥粉處理劑和焙烤食品的快速發(fā)酵劑[1-2]。但是，近期有大量研究表明經(jīng)過加工之后ADA的代謝產(chǎn)物并不安全。ADA在改善面粉品質(zhì)的同時(shí)也會(huì)在高溫?zé)峤鈼l件下產(chǎn)生其他有害副產(chǎn)物氨基脲（semiearbazide，簡(jiǎn)稱SEM）[3-4]；ADA還可經(jīng)小麥蛋白還原可轉(zhuǎn)化為聯(lián)二脲（biurea，簡(jiǎn)稱HDC），HDC進(jìn)一步降解又可轉(zhuǎn)化為SEM[5-6]，其轉(zhuǎn)化規(guī)律和分子結(jié)構(gòu)見圖1。研究表明，SEM具有致癌性和誘變性[7-9]，歐盟國(guó)家已經(jīng)禁止使用ADA[10]。但關(guān)于HDC毒性目前未見報(bào)道。因此，目前大部分研究報(bào)道主要是通過監(jiān)控ADA和SEM的量來研究其轉(zhuǎn)化規(guī)律。由于HDC既是ADA的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物又是ADA與SEM轉(zhuǎn)化的中間產(chǎn)物，其含量的監(jiān)控對(duì)于準(zhǔn)確了解ADA在加工過程的代謝規(guī)律起著重要作用。目前關(guān)于HDC的檢測(cè)方法僅有兩篇報(bào)道，謝黨[11]采用亞鈦還原法檢測(cè)工業(yè)原料中HDC的含量；Mulder等[12]用13C，15N2-SEM和13C-氰化鉀合成了內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物13C，15N2-HDC，建立了針對(duì)HDC的HPLC-MS/MS內(nèi)標(biāo)定量方法，檢測(cè)限達(dá)到10μg/kg，回收率80%。該文由于提取液未經(jīng)凈化，雜質(zhì)含量較多而產(chǎn)生離子抑制現(xiàn)象，從而選擇了內(nèi)標(biāo)定量法，同時(shí)也研究了稀釋倍數(shù)對(duì)離子抑制現(xiàn)象的影響，得出稀釋倍數(shù)大于200倍時(shí)，離子抑制現(xiàn)象最弱。鑒于該方法內(nèi)標(biāo)物合成過程復(fù)雜、成本昂貴，以及驗(yàn)證得出可通過增加稀釋倍數(shù)降低離子抑制，而且添加ADA的面制品中HDC含量為ppm級(jí)，含量高于質(zhì)譜檢測(cè)所需的ppb級(jí)，通過稀釋起到一定的降低離子抑制作用，本文擬采用固相萃取（SPE）凈化提取液，以期通過除去溶液中雜質(zhì)達(dá)到降低離子抑制的目的，從而無需內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行定量。本文通過研究HDC提取、SPE柱子的選擇、液相分離條件、質(zhì)譜檢測(cè)條件等，建立針對(duì)SPE凈化再采用HPLCMS/MS方法定量檢測(cè)，以期為面制品中HDC檢測(cè)提供一種可操作性強(qiáng)的簡(jiǎn)便方法。

圖1 偶氮甲酰胺（ADA）、聯(lián)二脲（HDC）、氨基脲（SEM）的轉(zhuǎn)化規(guī)律、分子結(jié)構(gòu)圖及SEM檢測(cè)衍生原理Fig.1 The molecule structure and metobolism of azodicarbonamide，biurea，semiearbazide and derivative principle during SEM detection

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

HDC標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液 稱取0.05g（精確到0.0001g）HDC標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用純水超聲溶解，定溶于100mL容量瓶中，制成0.5mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃保存；乙腈、甲醇 色譜純，美國(guó)TEDIA試劑公司；聯(lián)二脲標(biāo)準(zhǔn)品 純度均不小于99.0%，上海安譜公司；饅頭 蘇州超市。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀 島津高效液相色譜儀，日本島津公司；AB SCIEX 4000 QTRAP 質(zhì)譜儀 美國(guó)AB公司；色譜柱 XBridge BEH Amide色譜柱（3.5μm，4.6mm×150mm），美國(guó)Waters公司；SPE固相萃取柱 LC-18 SPE（500mg/3mL）小柱，上海安譜公司；IKA VORTEX 3漩渦混勻器 上海吉延環(huán)境儀器有限公司；TG16-WS離心機(jī) 上海盧湘離心機(jī)儀器有限公司；超聲儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HPLC-MS/MS檢測(cè)條件

1.2.1.1 色譜條件 采用XBridge BEH Amide色譜柱（3.5μm，4.6mm×150mm）；柱溫：35℃；流動(dòng)相：等度洗脫，V（CH3CN）∶V（H2O）=70∶30；流速：0.6mL/min；時(shí)間：8min。

1.2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧ESI，正離子模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM；離子噴霧電壓（Ion Spray Voltage）：5500V；離子源溫度T：600℃；霧化氣Gas1：55。MRM掃描參數(shù)如表1所示。

表1 HDC的MRM掃描參數(shù)Table 1 The MRM scan parameters of HDC

1.2.2 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取樣品0.5g（精確到0.0001g），加入20mL 純水，利用超聲提取20min。4500r/min離心5min，取1mL上清液定容至30mL，準(zhǔn)確取2mL稀釋液過LC-18固相萃取小柱進(jìn)行凈化，棄去流出液，最后用5mL甲醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，氮吹吹至干，準(zhǔn)確取1mL純水定容，過0.22μm水相膜，待用。

LC-18固相萃取小柱在使用之前先用3mL甲醇、3mL水進(jìn)行活化。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與最低檢出限 用去離子水稀釋HDC標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，配制最終濃度分別為0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并直接進(jìn)行HPLC-MS/MS測(cè)定。以HDC濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過不斷降低標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，取信噪比為3時(shí)的濃度為最低檢出限。

1.2.4 回收率和精密度的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取3份空白面粉0.5g（精確至0.0001g）作為基質(zhì)，分別添加HDC標(biāo)準(zhǔn)溶液，使得面粉中HDC含量分別為2.0、5.0、10.0μg/kg，按照樣品前處理步驟進(jìn)行處理，每個(gè)濃度水平下做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，再按照HPLC-MS/MS檢測(cè)條件進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定該方法的回收率與精密度。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件

本文研究了HDC的質(zhì)譜條件，證明HDC母離子（[M+H]+：m/z119）在正電噴霧條件下有較強(qiáng)的靈敏度，所以本文選擇正電離模式ESI。HDC在正電離模式下的MS/MS子離子掃描圖以及結(jié)構(gòu)圖如圖2所示。

圖2 HDC正電離模式MS/MS子離子掃描圖及其結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Product ion scan ESI MS/MS of HDC and the structures of the major fragment ions

2.2 色譜柱的選擇

通過對(duì)比Hypersil ODS2色譜柱、XBridge BEH Amide色譜柱以及MACHEREY-NAGEL Nucleosil氰基柱三種正反相色譜柱對(duì)HDC的保留情況（見圖3），證明XBridge BEH Amide色譜柱效果最好。因?yàn)镠DC極性較強(qiáng)，在Hypersil ODS2反相色譜柱上沒有保留；而在正相色譜柱上均有保留，且在XBridge BEH Amide色譜柱的峰形與響應(yīng)強(qiáng)度比MACHEREY-NAGEL Nucleosil氰基柱的效果好，因此，為了有較好的檢測(cè)效果，本實(shí)驗(yàn)采用XBridge BEH Amide色譜柱。

圖3 HDC在不同色譜柱上的分離效果Fig.3 The chromatograms of HDC on different columns

2.3 流動(dòng)相的選擇

HPLC-MS/MS中常用乙腈與加入微量甲酸或乙酸的水溶液作為流動(dòng)相，因?yàn)槲⒘康乃峥梢源龠M(jìn)物質(zhì)電離，因此選擇了乙腈作為有機(jī)相。通過對(duì)比0.1%甲酸水溶液、0.2%甲酸水溶液和純水作為水相時(shí)HDC的色譜峰（見圖4），說明用純水作為水相時(shí)，色譜峰相應(yīng)最高，峰形高而窄，且沒有分叉。其原因可能是因?yàn)樗x色譜柱為氨基柱，酸溶液對(duì)其柱效有較大影響。綜上所述，選擇乙腈作為有機(jī)相，純水作為水相。

圖4 不同流動(dòng)相對(duì)HDC色譜峰的影響Fig.4 The effects of different mobile phases on the chromatogram of HDC

2.4 流動(dòng)相比例與流速的選擇

根據(jù)上述選出的流動(dòng)相，通過不斷的調(diào)整乙腈與水的比例，對(duì)不同比例流動(dòng)相條件下HDC響應(yīng)值與峰形進(jìn)行了比較（見圖5），得出當(dāng)流動(dòng)相V（CH3CN）∶V（H2O）=70∶30時(shí)，其分離效果與響應(yīng)值最好，本研究以此作為所需流動(dòng)相比例。選用上述選好的流動(dòng)相比例，比較了流速0.8mL/min與0.6mL/min對(duì)分離效果的影響，發(fā)現(xiàn)改變流速對(duì)二者的分離與峰形影響不大，最終選用0.6mL/min，以節(jié)約溶劑。

圖5 不同比例流動(dòng)相對(duì)HDC色譜峰的影響Fig.5 The effect of different ratios of mobile phase on the chromatograms of HDC

2.5 線性范圍與檢出限

根據(jù)上述條件，采用HPLC-MS/MS檢測(cè)HDC的線性范圍為0.5～20μg/kg，線性方程為Y=3594.2+19523X，相關(guān)系數(shù)為0.9992，最低檢出限為0.1μg/kg。

圖6 HPLC-MS/MS分析HDC的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 The standard curve of detection HDC by HPLC-MS/MS

2.6 HDC提取溶劑與提取方式的選擇

圖7 不同提取溶劑與不同提取方式對(duì)HDC提取效果的影響Fig.7 The effect of different extraction solvents and extraction methods on the recovery ratio of HDC

由于HDC微溶于水、N，N-二甲基甲酰胺（DMF），不溶于多數(shù)有機(jī)試劑，但鑒于DMF粘度很大，因此，分別選用極性較強(qiáng)的水、甲醇、乙腈、5% DMF水溶液作為提取溶劑，以及振蕩提取、超聲提取與渦旋提取三種提取方式對(duì)加標(biāo)饅頭進(jìn)行了提取效果研究。根據(jù)圖7可知，采用水與5% DMF作為提取溶劑、超聲作為提取方式時(shí)，提取效果最好且相當(dāng)，考慮到DMF粘度大，對(duì)色譜柱有影響，所以選擇水作為提取溶劑。

2.7 固相萃取小柱及洗脫液的選擇

分別將HDC加標(biāo)面粉提取溶液通過Poly-Sery HLB SPE、NH2SPE、HC-18 SPE與LC-18 SPE四種固相萃取小柱，研究四種小柱對(duì)HDC的保留情況，結(jié)果表明，HDC在LC-18 SPE小柱上有較好的保留。由于合適的洗脫溶劑對(duì)于HDC檢測(cè)的效果以及回收率有著較大的影響，本文分別將甲醇、乙腈、正己烷、乙酸乙酯作為洗脫液，研究了不同洗脫液對(duì)HDC的洗脫效果。結(jié)果表明，使用甲醇作為洗脫液時(shí)，HDC回收率最高，可達(dá)到90%以上。因此，選用LC-18 SPE（500mg/3mL）小柱，甲醇作為洗脫溶劑。

表2 LC-18 SPE不同洗脫液HDC回收率測(cè)定結(jié)果Table 2 The recovery ratio of HDC on LC-18 SPE by different eluents

2.8 精密度與回收率

回收率與精密度測(cè)定結(jié)果見表3，回收率為89.00%～102.73%，大于Mulder等[12]方法回收率80%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5.0%，說明本研究建立的方法可靠。

表3 加標(biāo)面粉HDC回收率和精密度測(cè)定結(jié)果（n=5）Table 3 The average recovery and relative standard deviation of samples（n=5）

2.9 實(shí)際樣品測(cè)定

因?yàn)槊娣壑蠥DA經(jīng)過加工之后全部進(jìn)行代謝生成HDC、SEM[5-6]，因此在面制品中檢測(cè)不到ADA。應(yīng)用本方法對(duì)10批次市售饅頭中的HDC進(jìn)行檢測(cè)，以追蹤是否添加了ADA進(jìn)行。結(jié)果表明，多數(shù)樣品未檢出HDC，只有2個(gè)樣品檢出含有HDC，證明在該饅頭原料面粉原料中含有ADA。

表4 市售饅頭中HDC含量的測(cè)定結(jié)果Table 4 The content of HDC in market steamed bread

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，采用HPLC-MS/MS法檢測(cè)面制品中HDC，其線性方程為Y=3594.19+19522.69X，相關(guān)系數(shù)為0.9992，回收率為89.00%～102.73%，操作方法簡(jiǎn)單快捷，靈敏度高。

本次實(shí)驗(yàn)建立的利用HPLC-MS/MS法檢測(cè)面制品中HDC的檢測(cè)方法可以為今后進(jìn)一步研究ADA與HDC、SEM的轉(zhuǎn)化機(jī)理提供基礎(chǔ)方法，為面粉添加劑的安全性評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

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